생쥐 태아에서 간 줄기세포의 분리 및 배양

Abstract

간(liver)은 물질대사 과정에서 생성되는 독성물질이나 외부에서 유입되는 독성을 분해하여 해독 기능을 수행하는 장기로, 신진 대사의 중추적인 역할을 수행한다. 이러한 간세포의 물질대사 특성을 이용하여, 신약개발 시 질환모델 동물의 간에서 약물대사와 약물의 간독성을 검증하거나, 인간의 간세포(hepatocyte)를 연구대상으로 간암에 대한 병리학적 연구가 오랫동안 진행되어 왔다. 그러나 현재까지 알려진 배양방법으로 간세포는 체외에서 장기적으로 배양이 불가능하고, 체외에서 간세포를 배양할 경우 간세포 고유의 특성이 상실된다. 따라서 이런 단점을 극복하기 위한 대안으로 간세포로서의 특성을 지니며 장기간 배양이 가능한 간 줄기세포 활용의 중요성이 부각되어 있으며, 간 줄기세포의 분리 및 배양방법의 확립으로 이러한 문제점을 극복하려는 시도가 이루어지고 있다. 간 줄기세포(hepatic stem cell)의 특성을 유지하며 장기간 배양 가능한 조건을 찾기 위하여 ICR 생쥐 간을 이용하여 간 줄기세포의 분리 및 배양 실험을 실시하였다. 생쥐 태아의 발생 단계별 간 줄기세포의 증식과 분화양상을 분석하기 위하여 임신 E11.5, E12.5, E15.5 시기의 태아와 출생 1일, 성체 간 조직을 헤마톡실린과 에오신 염색을 통하여 세포의 형태변화와 RT-PCR을 통한 표지 유전자 발현을 비교분석한 후 다량의 간 줄기세포를 확보할 수 있는 E12.5일 생쥐 태아의 간을 배양에 이용하였다. 간 줄기세포의 초기배양은 Berry와 Friend (1969)가 이용한 방법과 Seglen (1972)가 이용한 간세포 일차배양 방법을 변용하여 시행하였다. 임신 후 12.5일된 ICR strain 생쥐의 태아에서 간을 분리하여 세절(mincing)한 후 0.025% collagenase를 처리하여 세포를 분리하였다. 분리된 태아의 간세포는 collagen type Ⅰ이 표면에 처리된 배양접시에서 HGF, EGF, bFGF를 포함된 배양액에 부유시켜 37℃, 7% CO2의 배양기에서 배양을 시작하였으며, 24시간 후 배양접시에 부착된 세포를 선택적으로 분리하여 배양하였다. 연속적인 계대배양 과정에서 간 줄기세포의 특징을 분석하였다. 배양한 간 줄기세포의 형태는 난원형태로 확인되었으며, 78일 동안 총 계대배양 13번을 거치며 32회 분열하였다. 배양된 세포에서는 줄기세포 표지인자인 Oct4, Nanog, Sox2가 발현되었으며, 간 줄기세포 표지자인 AFP가 강하게 발현되었으나, 상대적으로 간세포 표지자인 HNF4α는 발현율이 감소하였다. 세포의 세포면역화학적 염색 결과, 계대배양을 거치며 간 줄기세포에서 미분화 및 간 줄기세포 표지자인 AFP와 Oct4, Nanog, Sox2의 발현율이 감소하였으며 상대적으로 HNF4α와 albumin은 증가되는 양상을 보였다. 본 연구에서는 생쥐의 태아에서 추출된 간 줄기세포는 collagen type Ⅰ이 표면에 처리된 배양접시와 HGF, EGF, bFGF를 조합한 배양액에서 간 줄기세포 고유의 특성을 유지하며 간세포에 비하여 장기적으로 배양이 가능함을 확인하였으며, 이러한 생쥐 간 줄기세포의 배양방법은 인간의 간 줄기세포의 확립과 대량생산에 적합한 배양방법을 개발하는데 중요한 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.