분변내 스테로이드 호르몬의 측정을 통한 멸종위기 유인원류의 연중번식주기연구

Abstract

국 문 요 지 한양대학교 대학원 생명과학과 정소영

서식지파괴와 무분별한 밀렵, 애완동물밀무역 등으로 인하여, 전 세계에서 서식하는 유인원류는 현재 멸종위기에 처해 있다. 이들의 종보전을 위하여 IUCN, 생태계 종보전을 위한 국제연합 (the International Union for Conservation of Nature)에서는 멸종위기에 처한 동물들에 대해 등급을 부여하고, 국제거래에 관한 협약 (CITES, Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora)을 제정하여 이를 실행하고 있다. 이에 발맞춰 환경부는 멸종위기야생동물 종보전을 위한 서식지외보전기관으로서 서울동물원을 지정하여, 2006년부터 유인원류 종보전연구를 시작하였다. 이 연구에서 중점적으로 다루었던 생식주기 연구를 통하여, 유인원류의 유전적 다양성을 높이고 개체번식증대에 기여할 수 있을 것이라고 예상한다. 본 연구에서 다루었던 유인원류는 다음 3종인데 이들은 모두 국제멸종위기등급에서 멸종위기로 분류되어 있다; 고릴라 (Gorilla gorilla), 침팬지 (Pan troglodytes), 오랑우탄 (Pongo phygmaeus). 유인원류는 발정 징후를 뚜렷하게 노출하지 않기 때문에 생식주기를 외관상 가늠하기가 쉽지 않고, 또 연구를 위해 필요한 물리적 접근이 용이하지 않으므로, 간접적으로 유인원류의 생식주기를 측정할 수 있는 방법을 개발하고 연구하는 일은 매우 중요하다 하겠다. 간접적으로 유인원류의 생식주기를 측정하기 위한 방법으로서, 본 연구에서는 분변 내에 잔존하는 생식호르몬을 측정하는 방식을 선택하였다. 실험기간동안 실험대상의 분변을 1주일에 2~3일 간격으로 수거하여 잔존 호르몬의 양을 분석했고, 이를 바탕으로 연중 생식주기와 생식가능시기, 임신진단과 같은 생식패턴을 관찰하였다. 성호르몬대사산물의 분해를 방지하기 위하여, 분변은 수거 직후 초저온처리를 하였으며, 실험 전까지 안정된 상태로 보관하였다. 냉동건조법으로 분변에 함유된 수분을 제거하여 실험전 처리를 하였고 에테르과 PBS를 사용하여 성호르몬 대사산물을 추출하였다. 성호르몬 대사산물을 측정하기 위해 방사선물질을 사용하는 대신에 기존의 연구방법 중 분석감도가 가장 높다고 알려진 실시간형광항체분석법 (TR-FIA)을 사용하였다. 또한 소변과 혈청을 추가적으로 분석하여 이 안에 존재하는 성호르몬 대사산물의 수치를 분변 내 호르몬 수치와 비교하여 실험을 위한 보조자료로 참고하였다. 이 실험에서의 주요 측정대상은 스테로이드호르몬인 에스트라디올과 프로게스테론, 테스토스테론이었으며, 임신진단의 목적으로 인간융모성성선자극호르몬을 추가로 분석하였다. 본 연구에서 중점적으로 다룬 부분은 크게 세 가지인데, 첫째로 포유기간 동안 유인원류의 발정이 억제되는 현상, 둘째로 호르몬 분석을 통한 임신 여부 진단, 마지막으로 불임상태인 유인원류 개체의 번식연구이다. 침팬지와 오랑우탄은 포유기동안에 번식호르몬의 분비가 억제되기 때문에 장기간의 무월경 기간을 가지는 동물이다. 호르몬분석결과 분만 후 포유에 실패한 침팬지는 무월경기간은 75일로 단축되었고 이 시기 에스트라디올과 프로게스테론 최고농도상승이 관찰되었다. 새끼에게 계속 포유를 했던 오랑우탄은 새끼와 떨어지기 전까지 발정이 관찰되지 않았다. 이번 연구를 통하여 오랑우탄의 경우 포유기간에 에스트라디올 평균농도는 1.4ng/g, 프로게스테론 평균농도는 182.44ng/g으로 성호르몬 분비가 억제되어 발정이 지연된다는 것을 확인하였다. 침팬지와 오랑우탄의 임신진단을 위한 연구에 호르몬 분석방법을 적용하였다. 임신한 침팬지의 분변내 프로게스테론 유지농도는 임신 6개월에서 7개월까지 배란시 프로게스테론 최고농도인 621±211ng/g를 유지하였다. 마지막 8개월령 때 프로게스테론은 전월 대비하여 4~5배인 2,752± 518ng/g 으로 상승하였으며, 에스트라디올의 농도 역시 비슷한 양상을 보이며 상승하였다. 분만 전까지 이들 호르몬의 분비는 여전히 높은 수준으로 유지되었다. 임신한 오랑우탄의 경우, 혈청 내 프로게스테론농도는 비임신개체보다 30배 이상 상승하였으나, 인간융모성 임신진단호르몬은 종에 따라 차이를 보였다. 분변내 성호르몬 대사산물의 연구를 통해서, 오랜 기간 동안 불임상태였던 침팬지와 오랑우탄 암컷 개체, 그리고 고릴라에 대한 번식능력을 진단하고 이를 바탕으로 불임 문제에 대한 해결책을 마련할 수 있었다. 번식행동과 월경이 장기간 관찰되지 않은 암컷 침팬지의 성호르몬 그래프를 분석한 결과, 월경주기가 관찰되지 않고 성호르몬 분비가 억제되어 폐경 또는 산과질환이 있을 가능성이 추정되었다. 사후 부검결과 예측했던 소견을 증명해 주는 결과를 얻을 수 있었다. 오랑우탄의 경우에도 침팬지처럼 장기간동안 번식행동이 관찰되지 않았다. 그러나 호르몬 분석결과, 에스트라디올 최고농도는 6.10± 3.51ng/g, 프로게스테론 최고농도는 1,137±673.84ng/g로 상승하였고, 월경주기는 20.14±5.72일을 보였다. 호르몬분석결과에 의하여 오랑우탄은 번식능력을 가지고 있는 것으로 판명되어 수컷과의 합사 프로그램을 진행하였다. 따라서 유인원류의 번식능력은 연령에 절대적으로 영향을 받기 보다는, 개체별 번식능력의 차이, 산과질환의 유무, 배우자와 합사한 조건에서 나타나는 성적행동의 차이 같은 여러 가지 요인이 복합적으로 작용한다는 것을 알 수가 있다. 분변내 성호르몬 분석을 통해 장기간 번식이 없었던 한 쌍의 고릴라를 관찰한 결과, 35세 이상으로 추정되는 노령의 암컷 고릴라는 불규칙한 월경주기를 보였다. 또한 2009년의 에스트라디올과 프로게스테론 최고 농도는 전년보다 각각 14.18±3.78ng/g과 1,602.04±412.34ng/g으로 더 상승하였으며, 월경주기 형태도 계속 유지되었다. 37세 이상으로 추정되는 수컷고릴라의 분변내 테스토스테론농도는 암컷에 비하여 비슷하거나 낮은 농도를 유지하였다. 고릴라의 생식주기는 서열위치에 크게 영향을 받기 때문에 이들의 성공적인 번식을 위해서는 서열과 개체 변이에 따른 생식주기연구가 필요하다. 연구 결과를 기반으로 종합적으로 판단했을 때, 생식주기는 일반적으로 종특이적 패턴을 보이지만 개체의 특이적인 조건이 번식주기에 큰 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 본연구를 통하여 유인원류 생식주기에 대한 연구에 지침이 될 만할 근거를 확보했고, 각 개체의 생식능력 진단에 이를 적용한 결과, 2009년에 침팬지와 오랑우탄에서 성공적으로 새로운 새끼를 얻을 수 있었다. 분변내 성호르몬 대사산물 측정을 통한 연구방법이 유인원류의 생식주기 연구에 효과적임을 제시하였다. 유인원류는 유전학적으로나 생리학적으로 인간과 많은 특성을 공유하기 때문에, 이들에 대한 번식주기 연구자료는 이들의 종보전연구 뿐만 아니라 더 나아가서 인간의 폐경과 산과질환을 연구하는데도 유용하게 활용될 수 있을 것이다. 본 연구는 앞으로 멸종위기에 놓인 유인원류의 종보전에 중요한 역할을 할 것이다.; the repression of estrus during lactation period, pregnancy test by endocrinal analysis, and reproductive research on infertile primates. Chimpanzees and orangutans have long-term interbirth intervals (amenorrhea) during lactation period in which the secretion of reproductive hormones is repressed. In this experiment, when chimpanzee failed for lactation, the period of amenorrhea was reduced to 75 days, the peak concentration of estradiol and progesterone were occurred at this time. The estrus cycle of the orangutan during lactation period was inactivated until separated from the cub. The mean concentration of estradiol was 1.4ng/g, the concentration of progesterone was 182.44ng/g in lactation period. This led to the conclusion that lactation period could serve as the determinant to explain the delay and the reactivation of estrus cycle in chimpanzees and orangutans. The analytic data of reproductive hormones was used to test pregnancy in chimpanzees and orangutans. The concentration of progesterone in feces of pregnant chimpanzees recorded 621±211ng/g, the highest level of luteal phase during the 6th~7th month of pregnancy. At the 8th month, a month later, 4~5fold increase of was not only progesterone level but also estradiol level. The mean concentration of progesterone was 2,752±518ng/g at the 8th month. They remained at the same level until delivery. The concentration of progesterone in the serum of pregnant orangutan was 30fold higher than that in non-pregnant orangutan. However, the concentration of HCG in pregnant period was different by species. The fecal analysis of reproductive hormones in primates provided the solution for the infertility in primates. To diagnosis the female chimpanzee in which mating behavior and menstruation were not observed for a long term, the annual fluctuation of reproductive hormones were conducted. Because the estrus cycle was not observed and the reproductive hormones were restricted on experiment result, the female chimpanzee was possibly suffering from menopause or obstetrical disease. The result from autopsy corresponded with the hypothesis. Although the female orangutan showed no mating behavior, the peak concentration of estradiol was 6.10±3.51ng/g, the peak concentration of progesterone was 1,137±673.84ng/g, the estrus cycle was 20.14± 5.72days. The experiment result suggested that she has estrus cycle which implies that she is still capable of reproduction. Therefore, age is not the sole factor in determining the reproduction capability in primates; Abstract

The annual reproductive cycle of endangered primates by monitoring the steroid hormone measurements in fecal samples

So Young Jung Hanyang University College of Natural Sciences Department of Life Science

Numerous number of wildlife primates have been exposed to the risk of extinction by such imprudent human activities as poaching, and trafficking etc. In the effort of wildlife conservation, IUCN (the International Union for Conservation of Nature) has established 'the Red list' to classify the threatened species in terms of the risk of extinction, has regulated the international agreements : CITES ( Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora). To correspond to such efforts, Korean government, Department of Environment has designated Seoul Grand Park Zoo (SGPZ) as 'The Center for Wild life Conservation', and initiated 'the Research Project for the Conservation of Endangered Primates' since 2006. The 3 primates; Gorilla (Gorilla gorilla), Chimpanzee (Pan troglodytes), Orangutan (Pongo phygmaeus) classified as 'Endangered' by 'the IUCN red list' were chosen for one of the urgent conservation strategies of the government project. Generally, these primates do not display the signs of estrus cycle explicitly, and are not readily accessible to make physical examination, and blood collection. Therefore, it is reasonable to develop the indirect and non-invasive method of measuring steroid hormones in fecal sample during the reproductive cycles To monitor the reproductive patterns of these primates including annual reproductive cycle, breeding season, and pregnancy diagnosis, the fecal samples from the species were collected at every 2~3 days during the observation period. In order to prevent from the decomposition of metabolites of reproductive hormones (MRH), the samples were stored in deep-freezer immediately after the collection, and preserved in the same stable conditions until use. The fecal samples were lysophilized, and treated with ether and phosphate -buffered saline (PBS) to extract the derivatives of reproductive hormones. Instead of using radioactive isotopes, Time-Resolved Fluorescence Immuno Assay (TR-FIA) was used. This method was so far known as the most sensitive analytic method to trace MRH. In addition, the level of MRH that exist in serum as well as in urine, and compared the results with that from feces to provide the validity of the experimental results. The metabolites of estradiol, progesterone, testosterone were analyzed to monitor estrus cycle and human chorionic gonadotropin (HCG) was additionally measured for pregnancy test. The three features of primates endocrinology were focused; it is rather greatly influenced by the combination of various factors such as individual's fertilizing ability, presence of obstetrical diseases, the pattern of mating behavior, and the mental communication under the introduction of a mating partner. In addition, the pattern of reproductive hormones in the couple of geriatric gorillas were measured by fecal analysis. Although the female was 35 (or upper) years old, she still showed irregular menstrual period . Both the concentration of estradiol and progesterone measured in 2009 were 14.18±3.78ng/g and 1,602.04±412.34ng/g. The results in 2009 were higher than previous year, and the menstruation cycle was continuously observed in 2010. In contrast in the 37 (or upper) year-old male, the concentration of testosterone was the same or lower than that in the female. Since the success in gorilla's reproduction is determined by social hierarchy, it is essential to consider the interactions in captive group and individual's physical conditions for successful breeding. In conclusion, the result from the fecal analysis suggested that the pattern of reproductive cycle is basically species-specific but it may be greatly influenced by the individual's physical conditions. This project provided the foundation for the further research on primates reproduction. As a results, The new chimpanzee and orangutan cubs could have been gained in 2009, successfully. This suggests that the fecal analysis of MRH is such a powerful tool to research reproductive physiology in primates. Furthermore, primates share number of common genetical and physiological characteristics with human being. The research project in primates is not limited only to protecting the species, and can be extended also for shedding new light on understanding human menopause and obstetrical diseases. This research will play an important role in operating conservation project for endangered primates.