환경독성유전체 연구를 위한 마이크로어레이 기반 기술의 통합적 분석

Abstract

산업과 생활 방식이 발전함에 따라 환경유해물질도 따라서 증가하고 있으며 최근에 와서 환경유해물질에 대한 관심이 급속하게 발전되고 있다. 따라서 환경과 생활형태의 변화는 다양한 생태학적인 변화, 즉 생식적 결함, 간독성, 신경계 이상, 발암성 등의 증가를 가져오고 있는 실정이며, 전 세계적으로 최근에 와서는 환경유해물질의 독성에 대한 언급이 날로 늘어가고 있다. 그래서 본 연구에서는 잘 알려진 생식독성 물질, 신경계 이상 유발 발암성 물질 등에 대해서 미량 노출시에도 위해성을 예측할 수 있는 시스템을 개발하고, 그러한 물질들의 분자유전학적인 방법을 통해서 작용기전을 연구하였다.

첫 번째 연구에서는, 신경계 이상을 야기하여 발암성을 나타내는 휘발성유기화합물(VOCs) 및 다환방향족탄화수소물질(PAHs)에 대한 환경 위해성 예측 연구를 위해 HazChemTM Rat array를 제작하였다. Array의 contents를 확보하기 위해 대표적인 VOCs인 DCE, EBz, TCM 및 대표적인 PAHs인 B[a]p, B[a]a, Phenanthrene, Naphthalene을 Rat에 노출시킨 후에 liver를 적출하여 Rat genome array에 실험을 진행하였다. 각 물질군에 대해서 유의성을 나타내는 유전자들을 통계적인 기법을 사용하여 VOCs-specific significant genes 145개, PAHs-specific significant genes 259개를 선별하였다. 이러한 유전자들을 이용하여 HazChemTM Rat array를 제작하였다. 제작된 Array의 두 그룹의 환경 위해성 예측의 가능성을 검토하기 위해 유전자 선별에 사용되었던 물질을 이용하여 rat blood sample을 이용하여 검증하였다. 검증 실험 결과, 선행 실험에서처럼 두 물질그룹에 specific하게 반응하는 유전자들 및 두 물질 그룹을 효과적으로 구분할 수 있는 유전자들을 선별할 수 있었다. 이러한 결과는 제작된 array 기술이 두 물질 그룹에 대한 effect를 검출해 낼 수 있음을 나타내고 있으며, array를 기반으로 한 위해성 예측연구가 가능함을 나타내고 있다. 두 번째로 본 연구에서는, 기존의 환경유해물질과 생식독성과의 관계를 최 첨단기술인 microarray의 다양한 플랫폼을 적용하여 염색체 및 분자 수준에서 연구할 수 있는 바이오마커를 이용한 array 개발을 1차적인 목표로 두고, 생식 독성의 위해성 예측을 위한 array의 contents 확보를 위해 생식독성을 나타내는 물질을 이용하여 mouse in vivo, in vitro 실험을 통하여 물질 노출에 의해 발현 변이를 나타내는 유전자들을 선별하였다. 실험 결과, 이러한 생식독성물질에 의해 발현 변이를 나타내는 유전자들과 생식독성과의 폭넓은 연관성을 연구하기 위해 생식관련 유전자 65개를 포함하여 총 866개의 유전자로 구성된 생식독성 관련 array를 제작하였다. Array의 생식독성 위해성 예측의 가능성을 검토하기 위해 유전자 선별에 사용되었던 물질외에 추가적인 TTBT 물질을 이용하여 검증하였다. 검증 결과, 세가지 물질에 대해서 공통적으로 발현 변이를 나타내는 유전자들을 선별할 수 있었으며, 이러한 유전자들은 본 연구의 1차적인 목표였던, 생식독성과 관련된 유전자로서 많은 관련 연구들의 key가 될 것으로 사료되며, 제작된 RepTox array 또한 이러한 연구에 중추적인 역할을 할 것으로 사료된다.

세 번째 연구에서는, 주변환경에서 널리 퍼져 사용되고 있지만 편의성과 사용 정도에 비해 negative health effect에 대해서는 잘 인식되지 않은 bisphenol A에 대해서 그러한 negative effect를 분자수준에서의 mechanism 연구를 위해, 현재 널리 사용되고 있는 microarray-based methylation, miRNA, gene-expression technology에 대한 실험 결과에 대해서 BPA에 대한 epigenetic effect와 그에 따른 순차적인 regulation에 대해서 통합적인 분석을 진행하였다. Methylation array 실험 결과, miR-22 region에서 hypomethylation이 나타났으며, hypomethylation에 따른 miR-22의 발현 변이 양상은 array 실험 및 real-time PCR 실험을 통하여 발현 증가를 확인하였다. 또한 이러한 miR-22의 predicted target이 되는 유전자들의 발현 양상을 확인하기 위해 whole genome microarray로 실험을 진행하였으며, 결과적으로 apoptosis에 연관된 유전자들의 발현 변이가 두드러지게 나타났다. 이러한 결과들은 RNA inhibitor를 이용하여 miR-22를 저해시킨 후에 real-time PCR로 검증하였다. 또한 검증된 유전자의 protein 발현을 western blot으로 확인한 결과, gene expression 실험 결과와 동일하게 나타났다. 결과를 종합해보면, BPA의 노출에 의해 miR-22 region이 hypomethylation이 일어나서 miR-22의 발현이 증가되었고, 그로 인해 그의 target이 되는 MAPK signaling pathway를 매개로 하는 apoptosis-related gene들의 발현이 감소되었다. miR-22에 의한 이러한 결과들은 BPA에 대한 보다 폭넓은 연구에서 key가 될 것으로 사료된다. 이러한 결과들로 보아 BPA가 순차적인 genetic effect를 통해서 세포에 독성을 나타내고 있음을 나타낸다고 사료되며, 이러한 microarray를 기반으로 한 기법들을 모두 이용하여 분석을 진행하는 것 또한 독성연구에 필요한 부분이라고 사료된다.