보편전사억제인자 MMTR/DMAP1에 의한 세포 운명 조절

Abstract

DMAP1(Dnmt1-associated protein1)은 DNMT1 결합 단백질로 처음 동정되었으며, 염색질 수식화를 통해 유전자 발현 조절에 관여할 것으로 추정되었다(Rountree et al., 2000). 또한 DMAP1-DNMT1 복합체는 p33ING1-Sin3-HDAC 복합체와 상호작용하여 동원체 주위의 염색질을 이질염색질 구조로 유지시켜주며, 세포주기 S기 후반에 히스톤 수식화를 가져온다(Xin et al., 2004). DMAP1은 세포주기 S기 동안 DNMT1과 결합하여 전사억제 기능을 나타내며, S기 후반 동안에는 HDAC2와 DNMT1과 함께 DNA 복제점에 결합하여 전사억제성 염색질을 형성한다(Rountree et al., 2000). 또한 DMAP1은 NuA4/Tip60 히스톤 아세틸화효소(HAT) 복합체 및 ATP-의존적 크로마틴 리모델링 복합체 Swr1/SRCAP의 핵심구성원으로서 전사, DNA 손상에 대한 세포반응 및 세포주기 조절에 관여하는 것으로 밝혀졌다(Doyon et al., 2004, Jin et al., 2005). 본 연구실에서 생쥐 배아줄기 세포주로부터 새로운 유전자로 동정한 MAT1 의존적 전사 억제인자(Mat1-mediated transcriptional repressor: MMTR)는 DMAP1과 동일한 유전자이다. MMTR은 HDAC1(histone deacetylase 1)과 전사조절인자 TFIIH 복합체의 한 구성요소인 MAT1과 결합하여 전사억제 기능을 나타낸다(Kang et al., 2007). 또한 MMTR은 세포주기에 따라 발현양의 변화를 보이며, TFIIH 복합체의 구성요소인 CAK 복합체와 상호작용함으로써 G1/S 및 G2/M 기에서 세포주기를 억제하는 세포내재성 음성 세포주기 조절인자로 작용함을 밝혔다(Shin et al., 2010) . 따라서 MMTR/DMAP1은 다양한 기작에 의해 세포활동을 조절할 것으로 판단되지만, 어떻게 MMTR이 이러한 다양한 기능을 수행하는지에 대한 자세한 기작은 알려진 바 없다. 본 연구에서는 MMTR이 생쥐 배아줄기세포의 운명조절에 어떠한 역할을 하는지 분석하고자 하였다. MMTR 발현감쇄 및 과발현 생쥐 배아줄기세포주를 각각 제조하여 자가분열능과 분화능에 미치는 MMTR의 역할을 조사한 결과, 두 세포주 모두에서 자가분열능은 대조군 세포와 유사하였지만, 분화유도 시 대조군 세포 콜로니는 모두 분화한 반면 MMTR 발현의 변화가 있는 세포주의 경우 일부 세포 콜로니(20%)는 미분화를 유지하였으며 나머지는 분화초기에 세포사가 유발되었다. 본 결과는 배아줄기세포의 초기 분화과정에서 MMTR 단백질 양이 적당하게 유지되어야 하며, MMTR은 다양한 작용 기작을 통하여 배아줄기세포의 운명조절에 관여할 것임을 시사한다. MMTR에 의한 배아줄기세포의 운명조절에 대한 분자 기작을 알아보기 위하여 미분화(d0) 및 분화유도 후 3일째(d3)의 대조군, MMTR 발현감쇄 및 과발현 배아줄기세포주를 대상으로 마이크로어레이를 수행하여 발현 변화를 보이는 유전자들을 분석하였다. 예측한 대로 두 세포주에서 발현 변화를 보이는 유전자의 발현 양상은 단순한 양성 혹은 음성 상관관계를 나타내지 않고, 미분화 및 분화세포에서 각각 4 그룹으로 분류되었으며 분화와 미분화 과정을 통합할 경우 16 그룹으로 대별되었다. 따라서 배아줄기세포의 운명조절에 있어서 MMTR은 MMTR 의존적 혹은 비의존적으로 다른 단백질들과 다양한 복합체를 형성하여 전사억제 혹은 전사활성을 나타내며, MMTR 발현감쇄 및 과발현 배아줄기세포주에서의 초기 분화 저해는 이러한 다양한 복합체들의 비정상적 작용에 의한 유전적 불균형에 기초할 것으로 예측할 수 있었다. 그러나 마이크로어레이 분석에서 발현변화를 보이는 유전자는 MMTR에 의해 직접 혹은 간접적으로 영향을 받은 유전자들이므로, MMTR의 직접적인 표적 유전자들을 대상으로 MMTR 결합능과 유전자 발현 변화 양상을 분석할 필요가 있다. 이에 따라 미분화(d0), 분화 2.5 일째(d2.5) 및 분화 3일째(d3) 생쥐 배아줄기세포주를 대상으로 ChIP-Chip 및 ChIP-sequencing 을 수행하여 유전체 수준에서 MMTR의 결합부위를 동정한 후, 표적 유전자에 대하여 MMTR 결합 여부와 유전자 발현 양상과의 연관성을 분석해 보았다. MMTR은 대부분의 표적 유전자에서 전사 개시점을 중심으로 1kb 이내에 결합하였으며, MMTR 표적 유전자 중에는 발생/분화 관련 유전자가 가장 많았다. 또한 MMTR 표적 유전자의 40-50%는 전사인자 E2f1, Zfx, Myc, Rex 및 Klf4 의 표적 유전자이었으나, Pou5f1(Oct3/4), Nanog, Sox2 등의 핵심 줄기세포인자 모듈 및 Suz12와 같은 polycomb 모듈과는 표적 유전자를 공유하지 않았다. 따라서 MMTR은 배아줄기세포의 미분화 유지에 있어서 대부분 Myc 모듈 유전자와 함께 기능함을 유추할 수 있었다. 미분화세포에서 MMTR과 결합을 나타내던 결합부위는 분화(d2.5 및 d3.0)가 진행됨에 따라 대부분 결합능이 감소하였으며, 이에 따른 표적 유전자의 발현은 60% 이상의 유전자에서 증가하였다. 따라서 MMTR의 결합능 변화와 유전자 발현 양상의 변화 역시 4가지 유형을 나타내며, MMTR은 유전자에 따라 발현 억제 혹은 감소에 관여하였다. 분화과정 중 MMTR 결합의 감소에 따라 발현이 증가하는 유전자들은 세포 분화/발생에 관련된 유전자들이 많았으며, 발현이 감소하는 유전자들은 세포 대사, 스트레스 반응 등에 관련된 유전자들이었다. 한편 분화과정 중 MMTR 결합능이 증가하는 유전자들은 대부분 발현도 증가하였으며, 이들은 발생, 탈인산화 및 배아 형태형성에 관련된 것들이었다. 또한 MMTR 발현 감쇄 혹은 과발현 세포주를 대상으로 d0 및 d3에서의 4가지 발현변화 유형에 속하는 MMTR 표적유전자들에 대한 MMTR 결합능 변화를 비교한 경우, 모든 그룹에서 표적유전자들에 대한 MMTR 결합능은 대부분 감소하였으나, 발현양상은 감소하는 유전자와 증가하는 유전자를 모두 포함하고 있었다. 따라서 MMTR 결합능에 따른 표적 유전자의 발현양상은 유전자에 따라 다양하게 증가 혹은 감소함을 알 수 있다. MMTR 발현감쇄 및 과발현 세포주에서의 미분화와 분화과정을 통합하여 분류한 16개 그룹의 유전자 발현 변화양상을 MMTR 결합능과 비교할 경우, 타 그룹에 비해 일부 그룹(그룹 5, 8, 9 및 16)에서 MMTR 결합능 감소에 따른 발현이 증가하는 유전자가 많기는 하지만 전반적으로 상기와 유사한 양상을 나타내었다. 따라서, 본 결과는 미분화 및 분화과정 중에 MMTR은 다양한 단백질 복합체를 형성하며, 각 단백질 복합체는 표적서열과의 결합 유무에 따라 다양하게 표적 유전자의 발현을 억제 혹은 촉진할 것이라는 가정을 뒷받침한다. 마지막으로 배아줄기세포에 존재하는 MMTR 결합단백질의 동정과 이러한 결합단백질 복합체의 존재 여부를 각각 affinity purification-mass spectrometry 방법과 gel filtration chromatography-western blot 방법으로 분석하였다. MMTR 결합단백질로는 Tip60-p400 복합체의 구성단백질인 Trrap, p400, Ruvbl1, Ruvbl2, actin은 물론 DNMT3A, Cullin A, WDRD9, MITF, NEK2 등을 포함하여 수십 종에 이르는 단백질이 동정되었다. 순수 정제한 MMTR 복합체 단백질의 stoichiometry는 Tip60-p400 복합체 구성단백질의 stoichiometry와 차이를 보이는 것으로 보아 Tip60-p400 복합체의 일부 구성단백질을 포함하는 다른 다양한 복합체가 존재할 것으로 추론되었다. 또한 배아줄기세포에 존재하는 MMTR 복합체를 gel filtration chromatography로 분석한 결과 적어도 3가지 MMTR 복합체가 존재함을 확인하였다. 따라서 보다 정교한 방법(MS-MS spectrometry 및 co-IP)으로 분석하여야 배아줄기 세포주에 존재하는 복합체의 종류와 구성단백질을 동정할 수 있겠지만, 본 결과는 배아줄기세포에는 다양한 종류의 MMTR 복합체가 존재함을 시사한다. 결론적으로 본 연구에서는 MMTR 발현이 높거나 낮게 될 경우 표적 유전자들의 발현이 불균형하게 되어 초기 분화가 일어나지 못하고 세포사멸이 일어남을 밝혔다. 이러한 MMTR의 기능은 MMTR이 다양한 단백질과 복합체를 형성하며, 복합체 별로 MMTR 의존적 혹은 비의존적으로 표적 유전자 발현을 촉진 혹은 억제함으로써 나타날 것으로 추론되었다. 따라서, 배아줄기세포의 운명조절에 있어서 MMTR은 분자 가감저항기(molecular rheostat)로 작용할 것이라 제안한다.