인테인 기술을 이용한 유전자재조합 인상피세포성장인자(rhEGF)의 터미널 특이적인 mono-PEGylation

Abstract

세계 제약업계의 바이오의약품의 시장성이 점점 확대되면서 신약개발대비 큰 파급효과를 일으킬 수 있는 효과적인 “개량신약”(bio-simmilar/better) 개발에 대한 연구가 활발히 일어나고 있다. 개량신약은 기존 약물의 안정성과 활성을 제어하기위해 특정 부위를 수식하는 생물인식공학기술로 단시간에 발전할 수 있는 가능성을 가지고 있는데 특히 이중에서 PEGylation기술은 단백질의약품에 도입하여 상업적으로 성공한 기술이다. PEG (poly ethylene glycol) 고분자로 수식된 바이오의약품은 약물의 용해도 증가, 체내 반감기의 증가, 약물의 체내외 안정성 증가, 단백질 분해효소로부터 보호, 독성 감소, 외부 물질의 면역성과 항원성을 감소시킬 수 있는 약물학적 장점들을 지니고 있다. 하지만 PEG고분자와 약물이 결합하면서 활성부위가 가려지게 되는 masking 현상의 발생으로 약물의 활성에 큰 저해를 가져올 수 있는 단점이 있다. 따라서 활성을 최대한 유지하기 위해서 다른 원하는 부위와 결합시키는 특이적(site-specific)인 PEGylation, 천연의 단백질 구조를 변경하지 않으며 한 분자의 PEG가 아미노산 잔기를 수식하는 mono-PEGylation이 최근에 선호되고 있지만, 이를 위해 복잡한 실험설계와 다단계의 공정을 요구하게 된다. 이를 해결하기 위해 본 연구에서는 인테인과 연관된 융합단백질 기술을 이용하여 위치특이적인terminal-specific, mono-PEGylation하는 방법을 제안한다. 융합단백질은 목적단백질(rhEGF), 인테인(intein), 키틴 매트릭스 친화 도메인(chitin binding domain)의 세부분으로 이루어져 있으며 목적단백질의 활성부분이 인테인과 결합되어 blocking 하므로 융합단백질과 PEGylation 단계에서 PEG 고분자는 활성부분을 피하고 노출된 다른 부분을 수식하여 mono-PEGylation 을 성공적으로 수행할 수 있다. 또한 단백질 발현, 재접힘, PEGylation, 분리 및 정제의 여러단계를 다른 부반응없이 연속적인 공정으로 연결시켜 시간과 비용을 효과적으로 절감할 수 있다. 본 실험의 목적단백질은 rhEGF (재조합인상피세포성장인자)를 사용하였으며 N-terminal PEGylation조건 하에 공정을 수행하였다. rhEGF가 PEGylation 되었는지 알아보기위해 수행한PAGE (polyacrylamide electrophoresis) 실험에서 silver protein stain법과 PEG stain 으로 PEGylation돤 단백질과 PEG의 공유결합 여부를 각각 확인하였다. 목적단백질을 다른 단백질과 분리하여 회수하기 위해서는 분리정제공정이 중요하며 본 실험에서는IEX (ion exchange chromatography)와 GPC (gel permeation chromatography)를 비교하였다. PEGylated rhEGF는 IEX 의 loading 단계의 flow through에서 용출되며 계속적으로 연결되는GPC 공정으로 불순물을 제거하여 SEC-HPLC (size exclusion chromatography-high pressure liquid chromatography) 를 통해 분석한 결과, 높은 순도의 mono-PEGylates를 얻을 수 있었다.