High Performance Liquid Chromatography를 이용한 human plasma에서의 sultamicillin의 분석방법개발과 생체이용률시험

Abstract

Sulbactam은 베타-락탐분자와 같지만 그 자체는 매우 약한 항균 작용을 가지고 있다. Sulbactam은 세균성 beta-lactamase의 강력한 억제제로서 이 효소에 의한 불활성화로부터 페니실린류인 ampicillin의 가수분해를 방지할 수 있다. Sultamicillin의 적응증은 면역타협 및 면역적격 환자에서 여러 가지 강한 병원균에 의한 감염증의 경험적 치료와 복강내 감염과 같은 호기성 및 혐기성 혼합감염의 치료이다 Sultamicillin 정을 대상약으로 sultamicillin의 혈장시료처리방법, 및 High-performance liquid chromatography (HPLC) 분석방법을 확립하였고, 생물학적동등성시험 기준 (식약청고시 제2002-60호, 2002.11.22)에 따라서 건강한 성인 9명을 선정하여 sultamicillin tosylate (375 mg 정, 화이자 <유나신정>)를 1회 경구 투여하고 9시간 채혈하여, 혈장 내 농도를 정량한 후, 생체이용률시험(Bioavailability study)을 실시하여 K-BEtest (이영주 등, 1998)를 이용하여 sultamicillin tosylate (375 mg )정의 AUC, Cmax, tmax, Ke, 및 t1/2β 등 약동학적 지표들을 다음과 같이 산출하였다.

1. Ampicillin과 sulbactam 표준품을 5% acetonitrile에 녹여 농도 를 1 ㎎/mL로 만들어 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하 였던 blank 혈장으로 희석하여 ampicillin과 sulbactam의 혈장 중 농도가 각각 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 μg/mL 농도가 되도록 검량선용 표준혈장을 만들었다. Ampicillin의 분석방법 은 다음과 같다. 각각의 표준혈장 1.0 mL에 내부표준용액인 primidone용액 (100 μg/mL) 50 μL와 30%(w/v) sulfosalicylic acid 용액을 100 μL를 가한 다음 vortexing 하 였다. 15000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층을 0.22 μm syringe filter에 거른 다음 50 μL를 HPLC system에 주입하 였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적에 대한 ampicillin의 피크 면적비를 가지고 검량선을 작성하였다. Sulbactam의 분석은 다음과 같았다. 혈장 50 μL에 10 μL의 내 부표준물질(clavulanic acid, 25 μg/mL)과 150 μL의 acetonitrile을 첨가하고 30초간 진탕하였다. 실온에서 5분간 방 치한 다음 1400 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층을 얻었다. 상층 100 μL에 2 M의 imodazole 용액(pH 10.0) 100 μL를 넣 고 60℃에서 30분간 유도체화 시켰다. 짧게 원심분리하여 기벽 의 수분을 모아준 다음 10℃에서 48시간 반응시켰다. 15000rpm에서 5분간 원심분리한 다음 0.22 μm syringe filter 에 거른 후 100 μL를 HPLC system에 주입하였다. 분석기기로 UV-1806 UV detector를 장착한 Bio-Rad Acclaim HPLC를 사용하였고, 컬럼은 Capcell Pak C18 column(5 ㎛, 4.6 × 150 mm, Shiseido, Japan)을, 데이터 처리장치로는 CDM 1.1을 사용하였다. Ampicillin의 이동상은 20 mM potassium phosphate buffer와 acetonitrile의 비율을 90.5:9.5로 섞은 용액을 사용하였고, 유속은 1.5 ml/min, column oven의 온도는 50℃, UV 검출기의 파장은 220 nm였 다. 자동시료주입기의 온도는 10℃를 유지시켰다. Sulbactam의 이동상은 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 3.2)와 acetonitrile의 비율을 94:6으로 섞은 용액을 사용하였 고, 유속은 1.2 ml/min, column oven의 온도는 60℃, UV 검출 기의 파장은 325 nm였다. 자동시료주입기의 온도는 10℃를 유 지시켰다. 2. Sulbactam과 ampiciliin 모두 검출한계는 0.5 ug/ml 이며 0.5 ug/ml - 20 ug/ml 범위에서 Sulbactam은 우수한 직선성 (r2=0.99978)을 보였고 ampiciliin도 우수한 직선성 (r2=0.99607)을 보였다. 3. Sultamicillin tosylate (375 mg 정, 화이자 <유나신정>)의 각 약동학적 지표들은 sulbactam의 경우 AUC는 13.241±2.75 μg&#12539; hr/mL, Cmax는 7.044±178 μg/mL, Tmax는 0.781±0.31 hr, 반감기는 1.19±0.24 hr, Ke는 0.602±0.12 1/h로 나타났 다. Ampicillin의 경우 AUCt는 18.46±6.43 μg&#12539; hr/mL, Cmax 는 10.459±3.44 μg/mL, Tmax는 0.875±0.35 hr, 반감기는 1.769±0.66 hr, Ke는 0.434±0.14 1/h였다.