결핵균 Adenylate Kinase(AKmt)와 이의 돌연변이체(AKmtK/AKmtDM)의 구조적 메커니즘 연구

Abstract

2ADP)로서 에너지 물질대사와 nucleotide 합성에 관여한다. 진핵생물의 AK1과 Mycobacterium tuberculosis의 AK(AKmt)는 아미노산 서열에서 높은 상등성을 보이나, 활성에서는 AKmt가 AK1의 10%정도로 매우 낮다. AK1의 하전을 띤 아미노산이 효소활성 및 기질 친화도에 영향을 주는 것을 착안하여 유전자조합과 세포배양을 통해 AK1과 부분적으로 동일한 아미노산 서열을 갖도록 AKmt의 LID domain 중 음전하를 나타내는 Glu[122]를 양전하를 나타내는 lysine으로 변형시키고(AKmtK) p-loop의 non polar한 Ala[11]을 polar한 serine으로 double mutant로 변형시켜(AKmtDM) 활성을 비교한 결과 12배 이상 높은 활성을 나타내었다. 이와 같은 활성 변화의 규명을 위해 mutation이 기질 결합 전 효소 backbone mobility에 미치는 영향과 기질 결합으로 인한 촉매 활성 증가의 상관관계를 NMR과 분자동역학 실험을 이용한 구조적 메커니즘 연구를 통해 밝히고자 하였다. AKmt와 AKmtDM의 Chemical shift perturbation 분석 결과 Lys으로 치환된 122번 주위의 잔기들과 LID 도메인의 변화를 확인할 수 있었으며 더불어 α3의 말단 잔기 D54의 perturbation(0.116ppm)을 통해 AMP binding domain과의 inter-communication 영향을 예측할 수 있었다. AKmt과 AKmtDM의 15N T1, T2, 그리고 15N-{1H} heteronuclear NOE relaxation 분석을 통해 rotational correlation time(τm)이 10.725 ± 0.538ns와 11.104 ± 0.339ns로 AKmt가 상대적으로 compact한 구조를 가짐으로써 전반적인 운동성이 낮음을 알 수 있었다. Relaxation data를 이용한 Modelfree 분석 결과 AKmt와 AKmtDM의 각 amino acid 별 order parameter 차이로부터 ATP lid domain의 G128, D131, D132와 AMP binding domain α3 말단 R51, D54, A55, G56, D57들과 ATP 또는 AMP 기질 말단의 phosphate group과 밀접하게 결합할 것으로 보이는 E33를 포함한 I39, E44의 flexibility가 증가함을 알 수 있었다. 또한 GROMACS를 이용한 10ns 분자동역학 실험을 통한 PCA eigenvector 분석으로부터 ATP binding domain의 A11S와 E122K의 mutation이 분자 내 inter-communication을 통해 AMP binding domain의 운동성을 증가시켜 AMP의 결합력을 향상시킬 것으로 판단된다. ATP와 AMP가 결합했을 때의 chemical shift perturbation 분석 결과 세 효소 모두 ATP saturation 상태에서 G32, G85와 같은 AMP binding domain amino acid의 강한 perturbation(0.2ppm이상)이 나타나고 있음을 확인할 수 있었다. AKmt와 AKmtDM에 대한 기질 결합에 따른 binding domain perturbation 결과 AMP의 ATP binding domain 결합과 관련된 correlation R2값은 0.910/0.928(1H/15N)으로 상관성이 떨어짐을 알 수 있었으며 chemical shift direction 측정으로 AMP의 ATP binding domain 결합이 ATP결합을 방해할 것으로 보이는 것과 반대로 ATP의 결합은 AMP binding domain의 운동에 영향을 미쳐 결과적으로 AMP의 결합을 증가시킬 것으로 예상된다. NMR titration을 이용한 dissociation constant 분석 결과 ATP binding domain에서의 AKmtDM에 대한 ATP 결합력(Kd: 73 ± 33μM) 이 AKmt(498 ± 326μM) 보다 약 7배 정도 높은 결합력을 보였다. 더불어 AKmt의 경우 ATP saturation 후 AMP를 처리하였을 때 AMP 단독처리 보다 약 7.6배 낮은 748 ± 112Mμ의 Kd를 확인할 수 있었는데 AKmtK는 4.6배, AKmtDM은 약 3.9배의 AMP 결합 증가가 나타났다. 결론적으로 backbone dynamics 분석과 분자 동역학 실험으로부터 AKmtDM의 mutation은 E118과 K122의 charge-charge interaction과 p-loop의 수소결합 네트워크 강화를 통해 분자 결합 및 촉매에 중요한 역할을 하는 Arg123을 구조적으로 안정화 시킴으로써 분자인지 기능을 향상시켜 ATP결합을 높이고 결합력이 높아진 ATP의 기능은 AMP binding domain과 상호작용을 통해 AMP의 결합을 가속화 시킴으로써 Adenylate kinase의 활성을 증가시킴이 확인되었다.; Adenylate kinase(AK)는 ATP와 AMP사이에서 가역적 고에너지 인산화 작용을 촉매하여 ADP를 생성하는 효소(Mg‧ ATP + AMP ⟷ Mg&#8231