Human Adenylate Kinase(hAK1)의 합성 및 NMR을 이용한 구조 연구

Abstract

국문요지 Adenylate kinase (AK)는 인산화 촉매를 통하여 생체에너지를 생산하는데 관여한다. 아데닐산 인산화효소 (AK)의 동질효소의 경우 AK1∼AK6가 활발하게 연구되어 있으며, 최근 발견되어진 AK7∼AK8 까지 총 8개의 동질효소가 알려져 있다. 활성부위 구조상 짧은 형태(short form)에 속하며 높은 활성을 지닌 3종의 동질효소 (AK1, AK5, AK6)은 세포질에 존재하며 AK1은 광범위한 부분에서 발견되며, AK5는 뇌에만 존재하여 기억과 학습 부분에 관여한다고 알려져 있으며 AK6는 핵 효소라고 알려져 있다. 반면, 미토콘드리아의 막 사이에 존재하는 AK2와 미토콘드리아 기질에 있는 AK3, AK4는 구조상 긴 형태(long form)에 속한다. AK2는 세포소멸에 관여하며, AK3와 AK4는 세포증식에 아주 작게 관여하고 있다. 최근 발견된 AK7과 AK8은 사상체에 존재하며 아직 연구결과가 많지 않은 편이다. AK1은 194개의 아미노산로 구성되어 있으며 6개의 히스티딘을 포함하여 21.8KDa의 분자량을 가지며 ATP와 AMP 사이에서 가역적 고에너지 인산화 작용을 촉매하며 인간이 살아가는데 필요한 에너지 생산에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 인간의 근육 hAK1을 대장균에서 발현시키고 동위원소 13C와 15N으로 표식화된 단백질을 정제하여 NMR 시료로 사용하였다. hAK1의 HSQC 신호 지정을 위해서 Bruker 800MHz NMR 분광기를 이용하여 다양한 3-D NMR 실험을 수행하였다. HNCA, HNCO, HN(CO)CA, HN(CA)CO와 NOESY-HSQC 스펙트럼을 분석하여 아미노산 서열 및 1H,15N의 화학적 이동을 지정하였다. Varian 500 MHz NMR 분광기를 이용하여 hAK1에 ATP와 AMP 적정실험 및 T1, T2, NOE 실험을 시행하였으며 결합 영역 ATPbd와 AMPbd의 아미노산 잔기들의 화학적 이동의 크기와 방향을 추적하고 이를 해석하여 결합영역 활성부위의 구조적인 변화 및 결합 특성을 규명하였다.