진딧물류의 동정 및 위해성 진단을 위한 DNA Microarray 개발

Abstract

농수산 작물의 국제교역이 늘어남에 따라 외래 해충 종들의 유입도 늘어나고 있는데, 이런 해충들 특히 진딧물류의 경우 쉽게 다른 식물에 전염되며 이에 감염된 식물은 결국 병들거나 죽어서 소멸된다. 그래서 진딧물류와 같은 해충을 적절한 시기에 식물로부터 격리시키고 관리할 필요가 있다. 보통 계통분류학자들은 그들의 생활사나 성별 같은 형태학적 특징으로 구분하고 있지만, 육안으로 식별이 힘든 해충들을 형태학적 특징으로 구별하는 것은 전문가들 조차도 매우 어려운 실정이다. 또한 국내에 존재하지 않는 외래종이 반입 될 경우는 더욱 그러하다. 그러므로 유해한 진딧물에 대한 진단과 구별이 필요한 실정이다. 생물의 진단이나 동정하는 방법은 다양하나 최근에는 DNA 바코드라는 길이가 짧은 표준 염기서열을 이용한 방법이 다양한 연구에 사용되고 있다. 이러한 흐름에 맞추어 DNA 바코드를 이용한 마이크로어레이라는 유전학적 방법으로 진딧물의 종 동정 및 위해성을 진단하고자 하였다. 먼저, 동정할 국내에 반입된 진딧물을 선정하고, 선정된 진딧물 가운데 채소, 화훼류에 주요해충으로 알려진 복숭아혹진딧물의 살충제 저항성여부를 판별하여 위해성 진단을 시도하였다. 종 동정을 위해서 Cytochrome c oxidase subunit I 유전자를 타깃 (target) 으로 하여 염기서열의 변화 (variation) 을 분석하였고, 위해성 진단을 목적으로 살충제 저항성의 타깃유전자 (target) Acetylcolinesterase 유전자와 Voltage-gated sodium channel 유전자의 돌연변이 (mutation) 분석을 하였다. 그리고 종 판별을 위한 프로브 (probe) 와 저항성 판별을 위한 프로브 (probe) 를 디자인하여 silylated glass slide에 집적하여 DNA 마이크로어레이를 제작하였고 형광물질 (fluorescent dye) 이 표지된 프라이머로 target을 증폭시킨 후, 프로브가 집적된 DNA 마이크로어레이 위에서 교잡화 반응을 시켰다. 그 결과 23종을 동정하는 47개의 프로브와 살충제 저항성을 판별하는 12개의 프로브를 선별하였다. 종 동정을 위한 종 특이적 프로브들의 신호는 수치화된 값 4000 이상을 갖고, 살충제 저항성을 판별하는 프로브들의 수치화된 값은 2500 이상을 갖는다. 본 연구를 통해 진딧물의 종을 동정 할 수 있는 DNA 마이크로어레이와 복숭아혹진딧물의 살충제 저항성을 판별할 수 있는 DNA 마이크로어레이를 개발하였다. 이를 토대로 실험실뿐만 아니라 현장에서 적용 가능할 것으로 기대 된다.|As trade of crops has increased, aphid pests are being brought into the country. As the aphids exist on the growth area of plant, the growth of plants is seriously affected by aphid pest. However, the size of aphids is very small and they have several sexual morphs and life stage, it is difficult to identify species identification of the aphids based on morphological features for non-expert. Therefore, it necessitated distinguishing and identifying about harmful aphids. To solve this problem, we were trying to approach genetics using a DNA microarray. First of all, we selected the several aphids, which were into domestic, to be identified. Then we tried a risk assessment by analyzing which aphid among selected aphids has a insecticide resistance of Myzus persicae which is known as a main insect causing trouble to vegetables and flowering plant. We verified genetic variations in species of aphids and designed species-specific oligonucleotide probes by sequence analysis of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI). Additionally, the resistant and susceptible probes were designed by the mutations in AchE and VgSC gene of Myzus persicae analyzed for risk assessment of aphid pest. And DNA targets were generated with a fluorescent dye-labeled primer and then, hybridized onto a DNA microarray consisting of specific probes. Thus, forty-seven species-specific probes were selected for identifying 23 species and twelve probes selected for insecticide resistant. The signal intensity of each species-specific probe was > 4,000 arbitrary units and the signal intensity of each resistant or susceptible probe was > 2,500 arbitrary unites. In this study, we developed two microarrays that distinguish species of aphids and identify insecticide resistance in Myzus persicae. These microarrays will be expected to be possibly used for species identification and insecticide resistance in practical circumstances such as quarantine of agricultural crops.; As trade of crops has increased, aphid pests are being brought into the country. As the aphids exist on the growth area of plant, the growth of plants is seriously affected by aphid pest. However, the size of aphids is very small and they have several sexual morphs and life stage, it is difficult to identify species identification of the aphids based on morphological features for non-expert. Therefore, it necessitated distinguishing and identifying about harmful aphids. To solve this problem, we were trying to approach genetics using a DNA microarray. First of all, we selected the several aphids, which were into domestic, to be identified. Then we tried a risk assessment by analyzing which aphid among selected aphids has a insecticide resistance of Myzus persicae which is known as a main insect causing trouble to vegetables and flowering plant. We verified genetic variations in species of aphids and designed species-specific oligonucleotide probes by sequence analysis of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI). Additionally, the resistant and susceptible probes were designed by the mutations in AchE and VgSC gene of Myzus persicae analyzed for risk assessment of aphid pest. And DNA targets were generated with a fluorescent dye-labeled primer and then, hybridized onto a DNA microarray consisting of specific probes. Thus, forty-seven species-specific probes were selected for identifying 23 species and twelve probes selected for insecticide resistant. The signal intensity of each species-specific probe was > 4,000 arbitrary units and the signal intensity of each resistant or susceptible probe was > 2,500 arbitrary unites. In this study, we developed two microarrays that distinguish species of aphids and identify insecticide resistance in Myzus persicae. These microarrays will be expected to be possibly used for species identification and insecticide resistance in practical circumstances such as quarantine of agricultural crops.