국내에서 분리된 탄저균 HYU01의 분자적인 특성 분석

Abstract

탄저는 탄저균(Bacillus anthracis)에 의해서 야기되는 질병으로서, 세레우스균(Bacillus cereus) 그룹에 속하는 중요한 병원균이다. 탄저균은 제조단가가 낮은 반면에, 강한 잔존성과 높은 치사능력을 갖고 있어 전쟁이나 생화학 테러 등에서 무기로 사용될 수 있다. 이러한 탄저균의 자연상태에서의 발생이나, 테러 등의 용도로 사용되었을 경우에 대처하기 위하여 다양한 역학적 분석들과 제독방법들이 꾸준히 연구되어오고 있다. 본 연구에서는 분자적인 유전분석과 단백질체 분석들을 이용하여 위와 같은 탄저균 발발 시 대처방법에 대한 4가지 실험을 진행하였다. 첫째로, 다좌위 직렬반복변수분석법 (multiple-locus variable-number tandem repeat analaysis; MLVA)과 정준 단일염기다형성분석법 (canonical single-nucleotide polymorphisms; canSNPs)을 이용하여 한국 토양에서 분리된 탄저균 HYU01 균주를 분자적인 유전형 분석을 하였다. 8개의 유전자 자리를 이용한 다좌위 직렬반복변수분석법 결과, 총 26종의 다양한 탄저균들을 3개의 클러스터 (A3a, A3b, B1)로 분류하는데 성공하였다. 이어 13개의 유전자 자리를 이용한 정준 단일염기다형성분석법을 통해 3개의 클러스터들을 A와 B 크게 두 개의 계통 (A, B)으로, 작게는 12개의 하위그룹으로 추가적 분류를 하였다. 한국에서 분리된 탄저균들은 4개의 하위그룹으로 나뉘어졌는데 (B.Br.001/2, A.Br.005/006, A.Br.001/002, A.Br.Ames), 이 중 A.Br.001/002와 A.Br.Ames의 하위계통들은 아시아 중심부에서 주로 발견되며 서로 매우 가까운 유전형을 가지는 것이 관찰되었으며, B.Br.001/002의 하위계통에 속하는 균주들은 대부분 남아프리카 쪽에 존재하며, 몇몇 유럽과 캘리포니아의 소수지방에서도 발견되는 것으로 확인되었다. 둘째로, 다좌위 직렬반복변수분석법과 정준 단일염기분석법에 의해 나온 결과로부터 보다 세부적인 분류를 위해, 4개의 유전자 자리의 단일염기반복분석법 (single-nucleotide repeat)을 이용하여 총 26종의 탄저균에 대한 추가적인 분자적 계통분석을 수행하였다. 분석 결과, 탄저균들은 분리된 장소에 따라 2개의 그룹으로 나뉘어졌고, 특히 한국의 한 장소에서 발견된 탄저균 17종을 10개의 세부유전자형으로 계통 분류 할 수 있었다. 본 연구를 통해, 단일염기반복분석법은 세부 계통분류를 하는데 매우 적합한 강력한 방법이란 것을 증명하였으며, 한국 탄저균의 새로운 유전적 마커를 수립할 수 있었다. 셋째로, 탄저균 HYU01의 보다 확실한 유전형과 병원성에 대한 이해를 위해, 유전체 서열분석을 수행하였다. Solexa (Illumina, 미국) 과 454 GS FLX (Roche Life Sciences, 스위스)를 이용하여 분석을 진행하였고, Newbler와 SOAPdenovo 생물정보학 프로그램을 통해 나온 서열조각들을 조합하였다. 분석 결과, 탄저균 HYU01의 염색체 (5,227,419 bp)와 독성 플라스미드들인 pXO1 (181,677 bp), pXO2(94,830 bp)가 관찰되었으며, 현재 34개의 갭이 남아있다. 분석된 결과들을 바탕으로 이전에 서열이 밝혀졌던 다른 균주들과의 계통적, 구조적인 비교 분석하였다. 넷째로, 탄저균에 대한 일련의 살균방법과 관련된 실험으로서 탄저균에 산화적인 스트레스를 처리하여 탄저균이 산화적인 항균작용에 어떻게 반응하는지를 알아보기 위해 단백질 발현을 분석하였다. 이를 위해 한국형 탄저균 HYU01에 0.3 mM의 과산화수소를 처리하였고, 이를 단백질체 기법을 이용하여 발현 변화를 관찰하였다. 그 결과 총 60개의 다르게 발현되는 단백질들이 관찰되었으며, 이중 17개는 시간이 지나면서 그 발현되는 양이 변화하는 것이 확인되었다. 우리는 특히, 시간에 따라 변화하는 단백질들의 대사 및 방어 관련된 단백질들의 변화를 관찰하였고 이를 통해 밝혀지지 않은 탄저균의 산화적인 반응에 따른 대사적인 경로와 방어기작들을 연구하는데 도움이 되고자 하였다. 본 연구에서, 우리는 탄저균이 발발 시 대응을 위해 이를 통합적으로 다룰 수 있는 방법들을 연구하였다. 우리의 분자적인 분석결과는 하나의 한국형 표지(marker)로서 전체적인 표지 체계에 도움을 줄 것이며, 우리의 단백질체 분석결과는 살균방법을 발전시키고, 단백질의 산화적인 반응에 따른 기초적인 반응 기작을 규명하는데 공헌할 것이다.

|Anthrax is a bacterial disease caused by Bacillus anthracis (B. anthracis), which is an important pathogen in the Bacillus cereus group. This B. anthracis could be used for warfare or bioterrorism agent due to advantage of survivability and lethality, but low-cost. To handle these natural outbreaks or terrorism events, forensic and epidemiological analyses of clinical samples and treatment assays as a decontamination agent were studied consistently. In this study, to contribute of handling methods, molecular typing analyses and proteomic analysis were performed with four sections. First, molecular approaches including multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) and canonical single-nucleotide polymorphisms (canSNPs) analysis were performed for the genotyping of B. anthracis HYU01 isolated from Korea. We used 8-loci MLVA and 13 canSNP analyses for investigate the genetic population of B. anthracis isolates in Korea and for make the relationships with other B. anthracis from the world. In MLVA, twenty-six B. anthracis isolates are classified into A3a, A3b, and B1 cluster. These canSNP analyses subdivided the B. anthracis isolates into two of the three previously recognized major lineages (A and B). B. anthracis isolates from Korea belong to four canSNP sub-groups (B.Br.001/2, A.Br.005/006, A.Br.001/002, and A.Br.Ames). The A.Br.001/002 and A.Br.Ames sub-lineages are two closely related genotypes that are frequently found in central Asia. B. anthracis isolates belong to the B.Br.001/002 sub-group; this genotype is spread across most of southern Africa, some parts of Europe and a small region in California, USA. Second, to apply more fine-scale classification from the MLVA-canSNP results, SNR analysis was performed with B. anthracis strains from the Korean CDC (KCDC, 4 strains), reference strains (5 strains) and new isolates (17 strains) from four different regions in Korea. We used 4-loci SNR analysis that has powerful discrimination power and confirmed by previous studies with other B. anthracis strains. These B. anthracis isolates were classified into two groups following the region and 10 subgenotypes (SGTs) from new isolated strains. Through SNR analysis, we confirmed powerful resolution of SNR loci and established the new markers of B. anthracis strains in Korea. Third, to better understanding of B. anthracis HYU01 genotype and pathogenesis, genome sequencing was performed for analysis of new isolate in Korea. Solexa (Illumina, USA) and 454 GS FLX (Roche Life Sciences, Switzerland) were applied for sequencing analysis. And the data was assembled with Newbler and SOAPdenovo bioinformatics programs. Total chromosomes (5,227,419 bp), pXO1 (181,677 bp) and pXO2 (94,830 bp) were analyzed and 34 gaps were closed by PCR. Through these data, we established the new fully sequenced B. anthracis strain and get the new reference of further studies. Fourth, to analyze the oxidative stress response in B. anthracis, the protein expression profiling of B. anthracis strain HYU01 from Korea was performed by treated with 0.3 mM hydrogen peroxide. The proteomics-based approach were applied, and thereby observed how to prevent antimicrobial resistance. The results showed a total of 60 differentially expressed proteins; among them, 17 showed differences in expression over time. We observed time-dependent changes in the production of metabolic and repair/protection signaling proteins. These results will be useful for uncovering the metabolic pathways and protection mechanisms of the oxidative response in B. anthracis. In summary, the integrated handling methods presented in this dissertation could be evaluated against the situation of anthrax outbreaks. The molecular genetics approach will be helpful to develop the marker system in Korea to handle the natural outbreaks or terrorism. Moreover, our decontamination assays will be useful for the development of decontamination method and basic B. anthracis mechanism against to oxidative response.; Anthrax is a bacterial disease caused by Bacillus anthracis (B. anthracis), which is an important pathogen in the Bacillus cereus group. This B. anthracis could be used for warfare or bioterrorism agent due to advantage of survivability and lethality, but low-cost. To handle these natural outbreaks or terrorism events, forensic and epidemiological analyses of clinical samples and treatment assays as a decontamination agent were studied consistently. In this study, to contribute of handling methods, molecular typing analyses and proteomic analysis were performed with four sections. First, molecular approaches including multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) and canonical single-nucleotide polymorphisms (canSNPs) analysis were performed for the genotyping of B. anthracis HYU01 isolated from Korea. We used 8-loci MLVA and 13 canSNP analyses for investigate the genetic population of B. anthracis isolates in Korea and for make the relationships with other B. anthracis from the world. In MLVA, twenty-six B. anthracis isolates are classified into A3a, A3b, and B1 cluster. These canSNP analyses subdivided the B. anthracis isolates into two of the three previously recognized major lineages (A and B). B. anthracis isolates from Korea belong to four canSNP sub-groups (B.Br.001/2, A.Br.005/006, A.Br.001/002, and A.Br.Ames). The A.Br.001/002 and A.Br.Ames sub-lineages are two closely related genotypes that are frequently found in central Asia. B. anthracis isolates belong to the B.Br.001/002 sub-group