급성폐손상을 위한 HMGB1 box A와 SPLyase siRNA의 복합전달

Abstract

급성폐손상은 다양한 원인에 의해 발병되는 염증성 질환으로 가장 흔한 원인으로는 전신적으로 진행되는 세균감염(패혈증)과 외부인자에 의한 신체적 손상, 폐의 직접적인 손상 또는 췌장염에 따른 염증반응이 있다. 현재 급성폐손상의 치료법으로는 인공호흡기를 통한 기계환기와 같은 집중치료법과 항생제 치료, 승압제 투여와 같이 환자의 상태에 따른 지지치료외에는 효과적인 치료방법은 없는 실정이다. 본 연구에서는 아르기닌을 기반으로 한 양친매성 펩타이드인 R3V6를 유전자 전달체 및 치료효과를 가진 펩타이드 전달체로 이용하여 S1PLyase siRNA와 재조합된 HMGB1 Abox 펩타이드의 치료효과를 급성폐손상 동물모델에서 평가하였다 High mobility group box-1은 핵과 세포질에 존재하는 단백질로 3개의 도메인으로 구성되어 있으며 HMGB1은 receptor for advanced glycation end products(RAGE)를 통하여 염증반응을 유도한다. 그러나 3개의 도메인 중 도메인 A박스는 염증반응을 유도하는 HMGB1의 사이토카인 활성기능을 억제하는 길항자로 작용하여 항염증효과를 낼 수 있으며 양전하를 띄고 있어 음전하를 띄는 siRNA와 결합 할 수 있다. 한편 S1PLyase siRNA는 lipopolysacharide(LPS)에 의해 염증반응을 유발 하는 싸이토카인의 분비에 관여하는 p38 MAPK and NF-kB 경로를 억제하여 항염증효과를 낼 수 있다. 본 연구에서는 재조합된 HMGB1 Abox 펩타이드(rHMGB1 Abox peptide)를 DNA 재조합방법을 이용하여 제작하고 정제하였으며 이를 정전기적 상호작용을 통하여 음전하를 띄는 S1PLyase siRNA와 복합체를 형성하도록 하였다. 또한 이 복합체를 아르기닌을 기반으로 하는 양친매성 펩타이드인 R3V6와 정전기적 상호작용을 통해 S1PLyase siRNA /rHMGB1 box A peptide/R3V6 tertiary complex를 형성하여 세포실험과 동물실험에 이용하였고 그 효과를 확인하였다. 젤지연분석법과 듀얼루시퍼레이즈 어세이를 통하여 siRNA: rHMGB1 box A peptide: R3V6=1:3:20에서 siRNA가 최적의 효율을 보이는 비율임을 확인하였다. 유세포분석기와 형광현미경을 통하여 세포내로의 전달효율을 측정한 결과 폐 상피세포에서 R3V6,PEI25K와 Lipofectamine보다 더 높은 siRNA전달효율을 보임을 확인하였고 뿐만 아니라 싸이토카인 효소면역측정법을 통하여 S1PLyase siRNA와 재조합된 HMGB1 Abox 펩타이드는 각각 항염증효과를 보임을 확인하였으며 아르기닌을 기반으로 한 전달체로 함께 전달하였을 때 더 높은 항염증효과를 보임을 확인하였다. 또한 S1PLyase siRNA/rHMGB1 Abox peptide/R3V6 ternary complex의 생체 내에서의 항염증효과를 확인하기위해 마우스에 LPS를 처리하여 급성폐손상 동물모델을 만들었다. 이 동물모델에 S1PLyase siRNA/Carrier 복합체를 주입하고 폐 기관지 세척술 시행 후 얻은 폐 세척액과 폐 조직을 이용하여 싸이토카인 효소면역측정법을 통하여 싸이토카인 레벨을 측정하였다. 측정결과 급성폐손상 동물모델에서도 S1PLyase siRNA/rHMGB1 Abox peptide/R3V6 ternary complex의 항염증효과가 있음을 확인하였다. 이러한 실험을 통하여, S1PLyase siRNA/ rHMGB1 Abox peptide/ R3V6 ternary complex는 급성폐손상 동물모델에서 높은 항염증효과를 보이는 유전자/펩타이드의 복합치료방법이라고 예상된다.

|Acute lung injury(ALI) is an inflammatory disease, which is characterized by the increased lung vascular permeability, alveolar flooding and cytokine release. The Sphingosine-1-phosphate lyase(S1PLyase) is expressed by lipopolysacharide(LPS) and has a function of degradation of Sphingosine-1-phosphate(S1P). The S1P involved in barrier integrity, cytokine release, migration and neutrophils infiltration in lung alveolar spaces and inflammatory response. Therefore S1Plyase modulates LPS-mediated pro-inflammation pathway. The down-modulation of the S1Plyase can inhibit LPS-mediated p38 MAPK and NF-κB and reduce the LPS-induced cytokines secretion using siRNA target S1PLyase. Meanwhile the HMGB-1 box A peptide has been reported to be an antagonist HMGB1, which was proved as a pro-inflammatory cytokine. Thus, the rHMGB1 box A peptide can reduce the pro-inflammatory cytokine secretion and lead to anti-inflammatory effect. Also rHMGB1 box A peptide is a cationic peptide and can form siRNA/rHMGB1 box A peptide complex by charge interaction. The R3V6 amphiphilic peptides were added to siRNA/rHMGB1 box A peptide complex to form tight ternary complex. The siRNA/rHMGB-1 box A peptide/R3V6 ternary complex has higher delivery efficiency than siRNA/R3V6 complex, due to its stability. MTT assay showed that S1PLyase siRNA/rHMGB1 box A peptide/R3V6 complex was non-toxic to the cells. In vitro cell study showed that the S1PLyase siRNA/rHMGB1 box A peptide/R3V6 complex reduced the IL-6 and TNF-α levels, due to the anti-inflammatory effect of S1PLyase siRNA and rHMGB1 box A peptide. In addition, the S1PLyase siRNA/rHMGB1 box A peptide/R3V6 complex reduced inflammation reaction and apoptosis in lipopolysaccharides(LPS) mediated acute lung injury animal models. Therefore, S1PLyase siRNA/HMGB1 box A peptide/R3V6 complex may be useful for the treatment of acute lung injury.; Acute lung injury(ALI) is an inflammatory disease, which is characterized by the increased lung vascular permeability, alveolar flooding and cytokine release. The Sphingosine-1-phosphate lyase(S1PLyase) is expressed by lipopolysacharide(LPS) and has a function of degradation of Sphingosine-1-phosphate(S1P). The S1P involved in barrier integrity, cytokine release, migration and neutrophils infiltration in lung alveolar spaces and inflammatory response. Therefore S1Plyase modulates LPS-mediated pro-inflammation pathway. The down-modulation of the S1Plyase can inhibit LPS-mediated p38 MAPK and NF-κB and reduce the LPS-induced cytokines secretion using siRNA target S1PLyase. Meanwhile the HMGB-1 box A peptide has been reported to be an antagonist HMGB1, which was proved as a pro-inflammatory cytokine. Thus, the rHMGB1 box A peptide can reduce the pro-inflammatory cytokine secretion and lead to anti-inflammatory effect. Also rHMGB1 box A peptide is a cationic peptide and can form siRNA/rHMGB1 box A peptide complex by charge interaction. The R3V6 amphiphilic peptides were added to siRNA/rHMGB1 box A peptide complex to form tight ternary complex. The siRNA/rHMGB-1 box A peptide/R3V6 ternary complex has higher delivery efficiency than siRNA/R3V6 complex, due to its stability. MTT assay showed that S1PLyase siRNA/rHMGB1 box A peptide/R3V6 complex was non-toxic to the cells. In vitro cell study showed that the S1PLyase siRNA/rHMGB1 box A peptide/R3V6 complex reduced the IL-6 and TNF-α levels, due to the anti-inflammatory effect of S1PLyase siRNA and rHMGB1 box A peptide. In addition, the S1PLyase siRNA/rHMGB1 box A peptide/R3V6 complex reduced inflammation reaction and apoptosis in lipopolysaccharides(LPS) mediated acute lung injury animal models. Therefore, S1PLyase siRNA/HMGB1 box A peptide/R3V6 complex may be useful for the treatment of acute lung injury.