Human Adipose Tissue-Derived Extracellular Matrix-Based Scaffolds with Gradients in Physicochemical Properties for the Regeneration of Hard-to-Soft Tissue Interface

Abstract

Tissue engineering has used scaffolds, cells, and growth-stimulating signals to regenerate tissues such as skin, bone, cartilage, nerve, and so on. Recent advances in tissue engineering have led to engineering functional interface tissues, which bridge the gap between two different tissues such as the cortical-trabecular bone interface, the bone-cartilage interface, and the bone-tendon interface. Especially, the hard-to-soft interfaces such as bone-to-tendon region have a gradient in structure and composition, which is translated into a spatial variation of chemical, physical, and biological properties. This unique transitional tissue between bone and tendon is not normally recreated during natural bone-to-tendon healing. Simple surgical reattachment of these two dissimilar biological tissues therefore often brings a poor outcome. For example, the failure rate for rotator cuff repair has been reported to be as high as 94%. To address this clinical problem, it is critical to develop a new scaffold with a controllable gradation in structure and composition. Adipose tissue is the most prevalent tissue in the human body and contains various extracellular matrix (ECM) components, such as collagen, elastin, and laminin. Human collagen, which is a main component of bone-to-tendon interface, was obtained from adipose tissue through two successive major steps: (i) isolation of the ECM by pulverization, centrifugation, alkaline, and alcohol treatment; (ii) extraction of collagen from ECM by pepsin treatment in dilute acetic acid. Then, in order to mimic the bone-to-tendon interface, a multiphasic scaffold composed of four layers with different chemical composition was fabricated: (a) an upper layer of collagen matrix, mimicking the tendon region, (b) a first intermediate layer of cross-linked chondroitin sulfate-collagen, resembling the uncalcified fibrocartilage region, (c) a second intermediate layer of partially mineralized collagen, resembling the calcified fibrocartilage region, (d) a lower layer of mineralized collagen with a high extent of minerals, corresponding to the subchondral bone. In this thesis, I report the design and in vitro study of a multiphasic scaffold for formulating tissue engineering strategy for the regeneration of hard-to-soft tissue interface. The stratified scaffold was composed of four layers with different chemical compositions. Chemically graded scaffolds, made with hybrid constructs, provide a gradual transition in microenvironment and mechanical properties. Moreover, this human ECM -based scaffold displayed the ability to support the adhesion and proliferation of human fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts towards the matrix production. Overall, my results show great promise that the human ECM-based scaffolds can improve hard-to-soft insertion healing and maintenance for a long time after surgery. |종래의 조직 공학에서는 피부, 뼈, 연골, 신경 등의 단일 조직을 재생하기 위하여 지지체, 세포, 성장 자극 신호를 사용하는 것이 보편적이었다. 최근 조직 공학은 피질골과 해면질골, 골과 연골, 골과 건 조직과 같이 다른 두 조직 사이의 경계면을 기능적으로 설계하는 방향으로 진보하고 있다. 특히, 골-건 조직과 같은 경-연조직의 경계면은 공간적 변이에 따른 화학적, 물리적, 생물학적 특성의 차이로 인한 구조 및 조성의 구배를 갖고 있다. 이러한 골과 건 사이의 독특하고 과도적인 조직은 다른 조직과 달리 손상되고 나면 자연적으로 재생이 잘 되지 않으며, 이들을 재부착하기 위한 외과적 수술도 그 결과는 좋지 않다. 그 예로, 회전근 개 봉합 수술의 실패율은 94 퍼센트까지 달한다고 보고되고 있다. 이러한 임상적 문제를 해결하기 위해서는 구조 및 구성 성분의 구배를 조정할 수 있는 새로운 개념의 지지체를 개발하는 것이 중요하다. 지방 조직은 인체 내에 가장 널리 퍼져 있는 풍부한 조직으로써 콜라젠, 엘라스틴, 라미닌 등의 다양한 세포 외 기질 성분을 함유하고 있다. 우리는 지방 조직이 함유하고 있는 세포 외 기질의 주성분이자 골-건 경계조직의 주요 구성 성분이기도 한 콜라젠을 다음과 같은 공정을 통하여 얻을 수 있었다. (i) 지방 조직의 분쇄, 원심 분리, 알칼리 및 알코올 처리에 의한 세포 외 기질의 분리, (ii) 펩신이 함유된 초산 처리를 통한 세포 외 기질로부터의 콜라젠 추출. 그 후, 분리, 정제된 콜라젠을 이용하여 건-골 경계조직을 모방한 다상 지지체를 설계하였으며, 콜라젠 기반의 다상 지지체는 각기 다른 조성을 갖는 네 개의 층으로 제작되었다. (a) 건 조직에 해당하는 콜라젠 매트릭스 층, (b) 비석회화 섬유연골 조직에 해당하는 콘드로이틴-콜라젠 결합 층, (c) 석회화 섬유연골 조직에 해당하는 국부적으로 석회화된 콜라젠 층, (d) 골 조직에 해당하는 광범위하게 석회화된 콜라젠 층. 본 연구에서는 경-연조직 경계면 재생을 위한 조직 공학적 전략을 수립하기 위하여 다상 지지체를 설계, 제작하고 이에 대한 평가를 진행하였다. 각기 다른 화학적 조성을 갖는 네 개의 층으로 구성된 다상 지지체는 미세 환경 및 기계적 특성의 구배를 갖는 것을 확인할 수 있었으며, 다양한 인간 유래 세포의 부착과 증식을 촉진함으로써 조직 재생을 유도하는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, 인간 지방 조직으로부터 유래한 세포 외 기질 기반의 다상 지지체는 경-연조직 경계부위의 구조와 성분을 모사한 환경을 제공함으로써 손상된 경계부위의 재생 및 접합 수술 후 장기간 유지 등에 활용도가 매우 높을 것으로 기대한다.; (ii) extraction of collagen from ECM by pepsin treatment in dilute acetic acid. Then, in order to mimic the bone-to-tendon interface, a multiphasic scaffold composed of four layers with different chemical composition was fabricated: (a) an upper layer of collagen matrix, mimicking the tendon region, (b) a first intermediate layer of cross-linked chondroitin sulfate-collagen, resembling the uncalcified fibrocartilage region, (c) a second intermediate layer of partially mineralized collagen, resembling the calcified fibrocartilage region, (d) a lower layer of mineralized collagen with a high extent of minerals, corresponding to the subchondral bone. In this thesis, I report the design and in vitro study of a multiphasic scaffold for formulating tissue engineering strategy for the regeneration of hard-to-soft tissue interface. The stratified scaffold was composed of four layers with different chemical compositions. Chemically graded scaffolds, made with hybrid constructs, provide a gradual transition in microenvironment and mechanical properties. Moreover, this human ECM -based scaffold displayed the ability to support the adhesion and proliferation of human fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts towards the matrix production. Overall, my results show great promise that the human ECM-based scaffolds can improve hard-to-soft insertion healing and maintenance for a long time after surgery.