형광 공명 에너지전이 나노센서를 이용한 단백질 Kinase 활성 분석

Abstract

단백질 키나제 (protein kinase)는 세포의 정상적 기능과 관련하여 세포 증식 및 생장, 분화, 대사 및 세포사멸에 이르기까지 중요한 역할을 하고 있으며, 치료제의 개발 및 특정 신호전달과정 연구의 목표물질이 되기도 하는 중요한 단백질이다. 따라서, 빠르고 간단한 kinase 활성의 분석은 kinase의 다양한 생리학적 및 약리학적 기능을 이해하는데 있어서 반드시 필요하다. 본 연구에서는 빠르고 간단한 방법으로 펩타이드 기질이 인산화 되는 것을 측정하는 방법을 제시하였는데, 이것은 공여체로 사용된 양자점 (quantum dot, QD)과 수용체로 사용된 형광입자 결합 펩타이드 사이의 형광 공명 에너지 전이 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)를 이용한 분석법이다. 인산화 되지 않은 펩타이드/단백질과 비교하여 인산화된 펩타이드/단백질은 금속 배위결합 효과로 인해 아연 이온(Zn2+)이 있을 때 카르복실기로 코팅된 양자점 표면에 강하게 결합되어 결과적으로 더 높은 에너지 전이 효율을 나타낸다. 금속이온이 없거나, 아연이 아닌 다른 2가 양이온이 있는 조건에서는 에너지 전이의 효율이 변화하지 않았다. kinase 반응에 따라 양자점과 펩타이드 기질 사이의 에너지 전이의 정도가 조절된다. 이것과 함께 인산화된 아미노산의 수가 에너지 전이의 효율에 큰 영향을 미치는데, 이번 연구에서는 금속이온과 더 강한 결합을 보이는 2개의 인산기가 있는 펩타이드 기질이 한 개가 있는 펩타이드 기질보다 훨씬 높은 에너지 전이 효율을 나타내었다. 합성시킨 인산화된 펩타이드가 아닌 실제 kinase를 이용한 인산화 과정 후 동일한 조건으로 에너지 전이를 확인한 결과 인산화에 필수적인 요소인 마그네슘 이온 (Mg2+)이 에너지 전이의 억제제로 작용하는 것을 확인하였다. 따라서 인산화 반응 이후 형광 펩타이드만을 정제해내는 과정이 필요한데, 이것을 위해 NeutrAvidin-biotin결합을 이용한 침전법 및 탈염 방법이 사용되었다. 이상의 연구를 통하여 고안한 분석법이 고감도 및 선택적으로 protein kinase 활성 분석의 도구로 사용될 수 있는 잠재력이 있음을 확인하였고, 실시간 추적에 있어서 유용한 분석도구가 될 것으로 예상한다.