Recombinant CHO DG44 Cell 배양을 위한 새로운 화학 조성 지질 혼합물의 개발

Abstract

화학적으로 규명된 성분만으로 이루어진 화학 조성 배지에서 recombinant CHO cell을 배양하고자 하였다. 현재 자체 배지 내에 첨가하는 동물 유래 성분인 대구 간유 함유의 지질 혼합물(L5146,Sigma)는 recombinant CHO cell 배양에 사용되어 왔다. 대구 간유 함유의 지질 혼합물(L5146)을 1ml/L 첨가한 배양의 결과는 상용 화학 조성 지질 혼합물(L0288, Sigma) 1ml/L 첨가한 결과 대비 약70% 이상 높은 세포성장과 항체생산을 보인다. 위 결과에 따라 새로운 화학 조성 지질 혼합물의 개발이 필요하다. 대구 간유 함유의 지질 혼합물(L5146)은 cholesterol, tocopherol, cod liver oil fatty acids(methyl esters)로 구성되어 있으며, cod liver oil 내에는 vitamin A, vitamin D 그리고 fatty acids 등이 포함되어 있다. 먼저 지질 성분을 첨가하는 분산 방법의 확립 실험을 통하여 lipid의 배지 내 분산도가 세포성장 및 항체생성량에 중요한 요소임을 확인하였고, filtration 또는 sonication을 통하여 첨가하여야 한다는 결론을 얻어, 이후 실험들에 이 방법을 적용하였다. 자체 제작 배지 내 lipid source인 lipoic acid, linoleic acid의 장기 계대를 진행해 본 결과, lipoic acid의 단독 첨가조건의 세포성장 및 항체생성량이 가장 높았다. 이에 lipoic acid의 농도조절을 통하여 자체 배지 내 첨가량의 40x의 최적농도를 결정하였고, tocopherol, cholesterol, vitamin A, vitamin D를 여러 농도에서 혼합하여 추가 첨가하여 lipoic acid 40x+ cholesterol 0.25x, tocopherol 0.5x, vitamin A 1x, vitamin D 2x의 조성을 갖는 con2를 확립하였다. 이에 fatty acids 를 추가한 결과 성장과 항체생성량에서 큰 효과를 관찰할 수 없었다. 대구 간유 함유 지질 혼합물(L5146)을 첨가 했을 경우와 비교하여 con2 첨가 시 세포성장은 약100%, 항체생성량은 약60%를 얻었다. 낮은 항체생성량의 원인을 규명하고자 여러 rCHO cell line에서 추가로 실험을 진행하였다. Cell의 항체생산능력 자체의 손상 또는 저하가 아닌 배지 내 항체생성량을 높이는 유효한 성분의 부재, lipoic acid의 과량첨가로 인한 항체생성량의 저하를 확인하였고, 대구 간유 함유의 지질혼합물(L5146)의 실제가용화법과 본 연구에서 지질 혼합물의 가용화법이 다름에 따라 세포의 성장 및 항체생성량이 다르게 측정되어 다시 한번 배지 내 지질성분의 분산도의 중요성을 확인하였다. 새로 개발한 화학 조성 지질 혼합물의 성능이 세포의 성장과 항체생성량 면에서 모두 상용 화학 조성 지질 혼합물(L0288)보다는 높은 성능을 보이는 것을 확인하였다. Con2조성과 linoleic acid 1x를 함께 가용화하여 추가 첨가 시 대구 간유 함유의 지질 혼합물(L5146)첨가 대비 세포의 성장이 100%, 항체생성량이 80%이상으로 긍정적인 영향을 미쳐 이 조성을 새로운 지질 혼합물의 조성으로 최종 확립하였다.