시클로포스파미드가 흰쥐 신장에서 수분 저류에 작용하는 기전

Abstract

Cyclophosphamide can produce hyponatremia when hypotonic fluid intake is not limited. Because cyclophosphamide-induced hyponatremia was reported to occur without changes in plasma vasopressin in a patient with central diabetes insipidus, we hypothesized that cyclophosphamide or its active metabolite, 4-hydroperoxycyclophosphamide (4-HC), may directly dysregulate the expression of water channels or sodium transporters in the kidney. To investigate whether intrarenal mechanisms for urinary concentration are activated in vivo and in vitro by treatment with cyclophosphamide and 4-HC, respectively, we performed both animal and primary cultured cell studies. Water-loaded male Sprague-Dawley rats were given a single intraperitoneal cyclophosphamide injection. Primary cultures enriched in inner medullary collecting duct (IMCD) cells and IMCD suspensions prepared from male Sprague-Dawley rats were treated with 4-HC. In cyclophosphamide-treated rats, significant increases in renal expression of aquaporin-2 (AQP2) and Na-K-2Cl cotransporter type 2 (NKCC2) were shown by immunoblot analysis and immunohistochemistry. Along the collecting duct, apical translocation of AQP2 was demonstrated by immunofluorescence. In IMCD suspensions, cAMP accumulation in response to by 4-HC was significantly reduced by tolvaptan co-treatment. In both in vivo rat kidney and in vitro primary cultured IMCD cells, significant increases in AQP2 and vasopressin receptor type 2 (V2R) mRNA expression were demonstrated by real-time quantitative PCR analysis. Moreover, confocal laser scanning microscopy revealed that AQP2 targeting to the apical plasma membrane was remarkably increased when primary cultured IMCD cells were treated with 4-HC in the absence of vasopressin stimulation. We concluded that, in the rat kidney, cyclophosphamide may activate V2R and induce upregulation of AQP2 and NKCC2 or directly increase AQP2 trafficking in the absence of vasopressin stimulation, leading to drug-induced nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis (NSIAD).|연구 배경 저나트륨혈증은 임상에서 흔히 발생하는 전해질 장애로서 신장을 통한 수분 저류가 그 기전으로 중요하게 작용한다. 여러 가지 약물이 저나트륨혈증 원인 중 하나로 알려져 있으나, 신장에서 수분 저류를 유발하는 기전이 분명하지 않다. 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)는 암 혹은 자가면역질환 치료제로서 임상적으로 매우 유용한 약물이지만, 경정맥 투여될 경우 저나트륨혈증 부작용이 나타날 수 있다. 시클로포스파미드 투여에 따른 저나트륨혈증은 바소프레신 분비와 관계 없이 신장에서 바소프레신 작용을 강화시킬 것이라고 알려졌다. 그러나 실제로 시클로포스파미드 대사물이 신장에서 수분 저류를 자극하고, 또한 어떠한 기전으로 바소프레신 작용을 강화시키는지 이제까지 보고된 바 없다.

연구 목적 본 연구는 쥐 신장에서 시클로포스파미드 혹은 시클로포스파미드 활성 대사물(4-hydroperoxycyclophosphmide, 4-HC)이 수분 저류를 자극하여 요 농축을 강화시키는 기전을 조사하고자 시행되었다. 구체적으로 신장 요세관에서 수분통로와 나트륨운반체, 특히 집합관의 aquaporin-2 수분통로가 그 기전에 관여하는지 연구하고자 하였다.

연구 방법 본 연구를 동물실험, 세포실험 및 내수질집합관 부유액 실험으로 나누어 진행하였다. 동물실험은 체중 240~260 g인 웅성 Sprague-Dawley rat 을 사용하여 두 가지 프로토콜을 적용하였다. 1차 동물실험은 시클로포스파미드 25 mg/kg BW를 복강 내 1회 투여하고 12시간 후 종료하였고, 2차 동물실험은 시클로포스파미드 50 mg/kg BW를 복강 내 1회 투여하고 72시간 후 종료하였다. 시클로포스파미드 투여 용량은 예비실험 결과 신장에서 aquaporin 수분통로 발현 변화가 유도되는 것을 참고로 정하였다. 1차 동물실험에서 대조군과 실험군은 각각 6마리였고, 2차 동물실험에서 대조군과 실험군은 각각 7마리였다. 대조군에서는 시클로포스파미드 대신 같은 용적의 생리식염수를 복강 내 투여하였다. 동물실험 마지막 날에 대사케이지를 이용하여 요량, 요 오스몰농도, 혈장 전해질 농도, 혈장 크레아티닌 및 혈장 오스몰농도를 측정하였다. 또한 동물실험을 종료하면서 양측 신장을 적출하여 수분통로, 나트륨운반체 및 바소프레신-2 수용체 발현을 조사하기 위한 western blot analysis, 면역조직화학법 및 quantitative PCR 을 시행하였다. 세포실험을 위하여 웅성 Sprague-Dawley rat 신장으로부터 내수질집합관 세포를 일차배양 시켰다. 일차배양된 내수질집합관 세포에 시클로포스파미드 활성 대사산물인 4-HC를 24시간동안 처리하여 aquaporin-2 수분통로 단백 및 mRNA 발현 변화를 조사하였고, 면역형광 염색 후 공초점 현미경을 이용하여 aquaporin-2수분통로의 내수질집합관 세포 내 발현 분포를 조사하였다. 마지막으로, 4-HC자극에 따른 aquaporin-2수분통로 발현 변화의 세포 내 기전을 조사하고자 웅성 Sprague-Dawley rat 신장으로부터 내수질집합관 부유액을 제조하였다. 신선한 내수질집합관 부유액에 dDAVP, 4-HC 및 4-HC + tolvaptan(바소프레신-2 수용체 길항제)를 각각 30분간 반응시켜 cAMP 생성의 변화를 ELISA로 측정하였다.

연구 결과 1차 동물실험에서 실험 종료 시에 측정한 요량, 요 오스몰농도 및 혈장 나트륨 농도는 대조군과 실험군 사이에 모두 유의한 차이가 없었으나, 시클로포스파미드 투여군 신장에서 AQP2 (137 ± 10 vs. 100 ± 6%; p= 0.01) 단백과 NKCC2 (205 ± 32 vs. 100 ± 11%; p< 0.05) 단백 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 신장의 바소프레신-2 수용체 mRNA발현 역시 대조군(100 ± 13 %)에 비해 시클로포스파미드 실험군(169 ± 18 %)에서 유의하게 증가하였고(p< 0.05), AQP2 mRNA발현은 증가하는 경향이었지만 유의하지 않았다. 이러한 AQP2및 NKCC의2발현 증가는 면역조직화학법을 통해 각각 집합관과 비후상행각에서 재확인하였고, 면역형광 염색 후 공초점 현미경을 이용하여 형광을 정량화하였을 때 시클로포스파미드 투여군 신장에서 피질집합관과 내수질집합관 AQP2 단백이 뚜렷하게 내강막으로 이동한 것을 관찰하였다. 2차 동물실험 결과에서도 요 지표의 변화는 없었으나, 신장에서 AQP1 (115 ± 4 vs. 100 ± 6%; p< 0.05), AQP2 (201 ± 26 vs. 100 ± 13%; p< 0.01) 및 NKCC2 (149 ± 12 vs. 100 ± 19%; p< 0.05) 단백 발현이 대조군에 비해 시클로포스파미드 투여군에서 유의하게 증가하였다. AQP2 mRNA (135 ± 5 vs. 100 ± 10%; p< 0.05) 및 바소프레신-2 수용체 mRNA (127 ± 8 vs. 100 ± 9%; p< 0.05) 발현 역시 대조군에 비해 시클로포스파미드 투여군에서 유의하게 증가하였다. 일차배양된 내수질집합관세포에 4-HC 10 µM를 24시간 처리한 결과 AQP2 단백 발현이 유의하게 증가하였으나(118 ± 8 vs. 100 ± 10%, p< 0.05), 4-HC 30 µM 처리에서는 AQP2 단백 발현이 오히려 감소하였다(76 ± 12 vs. 100 ± 10%, p< 0.05). 특히, 면역형광 염색 후 공초점 현미경으로 관찰하였을 때 대조군에서 AQP2단백이 세포질과 세포막에 고르게 분포한 데 비해, 실험군에서는 바소프레신 자극이 없는 상태에서 4-HC 10 µM 처리에 의해 AQP2단백이 뚜렷하게 내강막으로 이동한 것을 확인하였다. 4-HC 처리에 의한 AQP2의 내강막 이동이 바소프레신 자극 없이 바소프레신-2 수용체를 경유하여 발생하는지 조사하고자 내수질집합관 부유액에서 cAMP 생성을 조사하였다. 그 결과, 대조군(8.5 ± 0.6 pmol/mg protein)에 비해 30분간 4-HC 반응 후 cAMP 생성이 유의하게 증가하였고(17.3 ± 0.6 pmol/mg protein, p< 0.01), 그 증가가 tolvaptan을 병합 투여에 의해 유의하게 둔화되었다(12.4 ± 1.1 pmol/mg protein, p< 0.01).

결론 이상에서 체내실험 결과 시클로포스파미드 투여에 의해 쥐 신장의 AQP2 수분통로, NKCC2 나트륨운반체 및 바소프레신-2 수용체 발현이 증가하였고, 체외실험에서는 시클로포스파미드의 활성 대사물 4-HC가 바소프레신 자극이 없는 상태에서 내수질집합관 세포의 AQP2 수분통로 및 바소프레신-2 수용체 발현을 증가시켰다. 또한 바소프레신의 영향이 배제된 내수질집합관 부유액에서 4-HC 자극에 의해 유도된 cAMP 생성 증가가 바소프레신-2 수용체 길항제인 tolvaptan 병합 투여에 의해 유의하게 차단되었다. 이러한 결과는 시클로포스파미드 투여에 의한 그 활성 대사물이 바소프레신 분비와 무관하게 바소프레신-2 수용체를 자극함으로써 AQP2 활성화를 유도하는 것을 시사한다. 이는 신성부적절항이뇨증후군(nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis)의 한 가지 원인으로서 시클로포스파미드가 작용한다는 새로운 소견으로 보인다.; Cyclophosphamide can produce hyponatremia when hypotonic fluid intake is not limited. Because cyclophosphamide-induced hyponatremia was reported to occur without changes in plasma vasopressin in a patient with central diabetes insipidus, we hypothesized that cyclophosphamide or its active metabolite, 4-hydroperoxycyclophosphamide (4-HC), may directly dysregulate the expression of water channels or sodium transporters in the kidney. To investigate whether intrarenal mechanisms for urinary concentration are activated in vivo and in vitro by treatment with cyclophosphamide and 4-HC, respectively, we performed both animal and primary cultured cell studies. Water-loaded male Sprague-Dawley rats were given a single intraperitoneal cyclophosphamide injection. Primary cultures enriched in inner medullary collecting duct (IMCD) cells and IMCD suspensions prepared from male Sprague-Dawley rats were treated with 4-HC. In cyclophosphamide-treated rats, significant increases in renal expression of aquaporin-2 (AQP2) and Na-K-2Cl cotransporter type 2 (NKCC2) were shown by immunoblot analysis and immunohistochemistry. Along the collecting duct, apical translocation of AQP2 was demonstrated by immunofluorescence. In IMCD suspensions, cAMP accumulation in response to by 4-HC was significantly reduced by tolvaptan co-treatment. In both in vivo rat kidney and in vitro primary cultured IMCD cells, significant increases in AQP2 and vasopressin receptor type 2 (V2R) mRNA expression were demonstrated by real-time quantitative PCR analysis. Moreover, confocal laser scanning microscopy revealed that AQP2 targeting to the apical plasma membrane was remarkably increased when primary cultured IMCD cells were treated with 4-HC in the absence of vasopressin stimulation. We concluded that, in the rat kidney, cyclophosphamide may activate V2R and induce upregulation of AQP2 and NKCC2 or directly increase AQP2 trafficking in the absence of vasopressin stimulation, leading to drug-induced nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis (NSIAD).