핵자기공명학을 이용한 human Adenylate Kinase 1 (hAK1)과 변이체 hAK1R138A에 대한 구조 연구

Abstract

Adenylate kinase (AK)는 ATP와 AMP를 기질로 하여 AMP의 인산화를 가역적으로 촉진하는 작용을 함으로써 세포내의 ATP, ADP 및 AMP의 균형을 유지시키고 에너지 대사, 핵간의 항상성 조절 그리고 세포들의 여러 신호전달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 밝혀진 구조 결정에 의하면 AK는 Core, AMP binding domain (AMPbd) 및 Lid domain (LID)이라는 3개의 핵심 도메인을 가지고 있다. 이 중 LID가 가장 큰 운동성을 갖고 있으며 AMPbd와 상호작용을 하여 ATP 및 AMP와 같은 기질들과의 결합에서 AK의 구조적 재배열을 이루는데 큰 역할을 한다. 인간 AK1의 삼차원 구조는 아직 결정되지 않았으며 다양한 돌연변이체 연구들이 활성부위를 확인하기 위하여 진행되고 있다. 본 연구에서는 LID에 위치한 Arg138을 유전자클로닝을 이용하여 알라닌으로 mutation한 hAK1R138A을 합성하였다. 사람 근육에서 추출한 AK1 합성유전자와 돌연변이체(AK1R138A)를 E.coli 발현 벡터에서 재조합하여 클로닝한 후 M9 세포에서 발현하였다. 발현시킨 단백질을 LC로 정제하여 최종적으로 hAK1은 0.520 mM, AK1R138A는 0.252 mM의 농도를 실험에 사용하였다. 다핵다차원 NMR 실험으로 2D HSQC를 포함한 3D HNCA, HNCO, HN(CO)CA, HN(CA)CO 및 NOESY-HSQC 실험으로 아미노산 서열 분석과 NMR 신호 지정을 을 완료하였다. 또한 backbone dynamic 분석과 분자 docking dynamic simulation이 구조적 변화와 기질의 결합 부위를 찾기 위하여 실행되었다. 화학적 이동값의 차이를 분석한 결과 알라닌으로 치환된 138번 주위의 잔기들과 LID 도메인의 변화를 확인할 수 있었으며 또한 138번과 떨어져 있는 valine179의 perturbation (0.22ppm)을 통해 inter-communication 영향으로 전체적인 AK1의 구조에 변화가 생겼음을 유추할 수 있었다. hAK1과 AK1R138A의 15N T1, T2, 그리고 15N-{1H} heteronuclear NOE relaxation 분석을 통해 rotational correlation time (τm)이 11.0 ± 2.65 ns와 12.11 ± 5.52 ns로 hAK1이 전반적인 효소의 운동성이 큰 것으로 나타났다. relaxation data를 이용한 Modelfree 분석 결과에서도 전체 구조에 대한 order parameters (S2)값이 0.89 ± 0.09에서 0.94 ± 0.15로 커짐을 확인하여 전체적인 효소의 유연성이 hAK1이 더 큰 것으로 나타났다. 기질로 ATP와 AMP를 사용한 NMR 적정실험을 진행하였고 매 적정시 마다 HSQC 실험을 통하여 펩타이드 결합의 1H와 15N의 NMR 신호지정을 수행하였다. NMR 적정실험으로부터 해리상수(Kd) 분석 결과 ATP 결합부위에 대한 hAK1과 AK1R138A의 해리상수는 0.079 ± 0.015 mM, 0.080 ± 0.025 mM로 서로 유사하였다. 그러나 AMP 결합부위에 대한 AK1R138A의 해리상수는 0.775 ± 0.159 mM, hAK1은 0.250 ± 0.152 mM로 AK1R138A가 약 3.1배 정도 큰 해리상수를 나타내었다. Mutation에 의한 AMP 해리상수에서의 차이는 AMP와 결합시 효소의 전이상태에서 구조적 안정성에 기인함을 알려준다. 또한 docking dynamic simulation에서도 hAK1의 R138은 AMP의 인산기 부근에 위치함이 확인되었다. 또한 독특하게 R138은 R44와 나란히 위치하여 AMP의 인산기 근처에 위치하고 정전기적인 상호작용이 형성되어 이것이 hAK1과 기질들사이의 전이상태의 구조적 안정화에 기여할 것이다. NMR 실험으로부터 구해진 ATP 및 AMP와의 해리상수 값들, 화학적 이동값의 차이들, 전체적인 rotational correlation time 및 dynamic simulation 결과들은 R138을 알라닌으로 mutation시켜 얻은 hAK1R138A의 효소 전체 및 LID의 운동성이 hAK1 보다 감소하였음을 보여준다. 또한 생화학적인 활성시험에서 확인된 것처럼 AK1R138A의 전이상태에서 감소된 구조적 안정성이 hAK1 보다 AK1R138A의 효소 활성을 감소시킴을 보여준다.