핵자기공명법을 이용한 IgG 항원 Apo B-100 유래 펩티드(A)의 구조연구

Abstract

Low density lipoprotein (LDL)의 주요 구성 성분인 apolipoprotein B-100 (apo B-100)은 LDL receptor와 결합하는 부위로서, 혈중 콜레스테롤의 운반에 중요한 역할을 한다. LDL의 변형은 주로 아세틸화 또는 MDA (malondialdehyde)에 의한 산화로부터 발생하며, apo B-100과 LDL receptor의 결합을 저해하고 acetyl LDL receptor와의 결합을 촉진하여 콜레스테롤의 과도한 축적을 일으킨다. 산화로 인한 apo B-100 내 lysine을 포함한 아미노산들의 구조 변형은 동맥경화 유발의 직접적 요인이 된다. Apo B-100의 부분 peptide인 P1-P302에 대하여 MDA 처리를 통해 산화시킨 후 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 분석을 통해 동맥경화 유발 peptide를 식별한 선행 연구를 토대로, 산화된 peptide에 대하여 IgG (immunoglobulin G) 수치가 높게 나타나는 group A의 peptide P11 (FLDTV YGNCS THFTV KTRKG), P25 (PQCST HILQW LKRVH ANPLL), P74 (VISIP RLQAE ARSEI LAHWS)에 대한 구조 연구를 진행하였다. Peptide의 구조 정보를 얻기 위하여 CD (circular dichroism) 측정 및 NMR 실험을 수행하였다. CD spectrum을 해석한 결과 세 peptide 모두 약한 α-helix를 가지며 P11은 random coil이 혼합된 구조를 가질 것으로 나타났다. 동핵간 2D NMR 실험기법인 correlation spectroscopy (COSY), total correlation spectroscopy (TOCSY), nuclear overhauser effect spectroscopy (NOESY) 실험을 통하여 각 peak의 신호를 지정하였고, NOESY spectrum에서 아미노산 잔기의 intraresidual 및 interresidual NOE connectivity 수소핵간 거리정보를 얻어 구조 결정에 활용하였다. 완벽한 NMR 신호 지정을 위하여 NMRViewJ와 Excel S/W를 이용한 Hanyang Automated NMR Signal Assignment Tool (HANSAT)을 개발하였다. 같은 아미노산 잔기와의 상호작용으로 인해 나타난 peak들은 x좌표 혹은 y좌표의 chemical shift 값이 거의 일치하므로, NMRViewJ의 peak pick 기능을 통해 얻은 각 peak들의 chemical shift 정보를 토대로 Excel의 고급필터와 매크로 기능을 이용하여 같은 아미노산 잔기와 상호작용을 가지는 peak들을 찾을 수 있었다. 겹쳐진 peak들은 spectrum의 contour level에 따른 peak pick 정보를 비교함으로써 각각의 peptide로부터 얻어진 중첩된 NMR 신호를 구분할 수 있었다. NMR 실험으로부터 얻은 공간 정보를 기반으로 distance geometry (DG)와 molecular dynamic (MD)을 수행하여 P11, P25, P74의 구조를 결정하였다. 각 peptide의 최종 액상 NMR 구조를 얻기 위하여 NOE back calculation과 2D NOE spectrum 계산을 실행하였다. 임의 구조에서 얻어진 이론적 2D NOE spectrum이 실험에서 얻어진 NOE spectrum과 일치할 때까지 분자 동력학을 실행하여 최종 구조를 결정하였다. 그 결과 P11은 Thr[4]-Ser[10]에서 약한 α-helix를 이루며 그 외의 residue에서 random coil이 혼합된 구조로 나타났다. P25는 Pro[1]-Arg[13]에서 α-helix가 나타났으며, Asn[17]-Leu[20]에 β-turn이 혼합된 구조를 확인할 수 있었다. P74는 Pro[5]-Gln[8]과 Arg[12]-Trp[19]에서 β-turn과 α-helical 구조가 혼합되어 나타났다. 최종 결정된 구조에 대한 검증 과정으로, NOE connectivity 공간 정보로부터 Ramachandran plot을 확인하였다. 세 peptide 모두 α-helix에 대한 분포도를 확인할 수 있었다. Apo B-100의 38개의 부분 peptide에 대하여 산화되기 전과 후인 native state와 modified state의 구조 규명이 모두 이루어진다면, 변형 메커니즘 및 구조적 특성을 이용하여 LDL의 산화부위를 인식하는 항원기 백신을 개발하거나 산화 부위를 차단함으로써 동맥경화를 예방하는 연구의 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.