Fabrication of Ceramide-based Biovehicles for Improved Skin Barrier Function and Dermal Delivery

Abstract

최근 효능물질 피부흡수촉진 또는 피부장벽개선 등 피부효능을 향상시켜 주는 코스메 슈틱 연구분야가 많은 주목을 받고 있다. 세라마이드는 이러한 코스메슈틱 연구에서 많은 주목을 받아 온 소재 중 하나로 피부장벽 및 보습개선에 효과가 있다고 알려 졌다. 또한, 세라마이드는 피부각질층 세포간지질의 주요성분 중 하나로 피부장벽효과 등 인체의 항상성 유지에 많은 기여를 한다고 알려졌다. 하지만, 세라마이드는 높은 결정성으로 인하여 콜로이드 제형내에서 겔링 또는 석출 등의 이슈가 있기 떄문에 화장품 산업에서의 범용적인 활용이 어렵다. 본 연구에서는 콜로이드 제형내에서 세라마이드 안정화를 통해 피부장벽회복 및 피부흡수촉진 등 세라마이드를 함유한 피부전달체의 피부효능 향상효과를 검증하고, 그 기작에 대한 고찰을 하고자 한다. 먼저 레시틴의 자기조립 특성과 지질 분자간 상호인력을 이용하여 세라마이드가 함유된 나노전달체(CNV)를 제조하였다. 그리고, 동적 광산란 (DLS), 시차주사 열량분석(DSC), 광각X선산란(WAXS) 및 육안관찰을 통해 세라마이드 함유 나노 전달체(CNV)의 콜로이드 안정성을 보여주었다. 한편, CNV의 피부효능 향상효과를 검증하기 위해 3D 인공피부 모델과 소각X선 산란 장치 (SAXS)를 이용하여 in vitro 피부장벽회복 실험을 수행하였다. 세포간지질 라멜라 구조를 형성하는 지질들의 일정한 주기인 LPP(long periodicity phase)는 피부장벽에 대한 간접적인 측정지표가 될 수 있다. 먼저 음이온 계면활성제인 SDS를 이용하여 피부를 인위적으로 손상시킨 후, SAXS 분석을 통해 LPP 손상을 확인하였다. 이후, 세라마이드 미함유 나노 전달체(NV)와 CNV를 각각 처리하다. 그 결과, NV 처리시에는 아무런 변화도 없었지만, CNV 처리시 LPP 복원을 확인할 수 있었다. 이를 통해 세라마이드의 피부장벽회복에 대한 직접적인 증거를 확인하였다. 마지막으로 CNV의 피부흡수 촉진효과를 알아보기 위해 공초점 라만분광을 이용한 in vivo 임상시험을 수행하였다. 그 결과, 세라마이드에 의한 피부흡수촉진 효과를 확인할 수 있었지만, 세라마이드에 의한 피부흡수촉진의 직접적인 기작은 규명하지 못했다. 최근 지방산 및 콜레스테롤 등 지질원료들에 의한 각질층 유동화에 대한 연구결과가 많이 보고되었다. 이를 통해 세라마이드의 피부흡수촉진 기작에 대한 영감을 얻을 수 있다. 즉, 세라마이드에 의해 각질층 지질성분이 유동화되어 지질들간의 packing 구조가 느슨하게 하고, 그 사이로 많은 효능성분들이 피부속으로 침투하게 된다는 가설을 가능하다. 두 번째로 세라마이드의 안정적 함유를 위한 액정에멀젼을 제조하였다. 편광 현미경 관찰 결과, 고급 지방 알코올은 액정에멀젼의 고차구조 형성에 필수적이며, 계면활성제는 고차구조의 안정화에 매우 중요한 역할을 수행한다. 계면활성제와 고급 지방 알코올 사이의 인력이 부족할 경우, 고차구조가 없는O/W 에멀젼이 형성되고, 충분한 인력이 존재할 경우 액정에멀젼이 형성된다. SAXS 분석 결과, 이러한 고차 구조는 200 Å의 층간거리를 갖는 라멜라 구조임이 확인되었다. 본 연구에서는 액정 에멀젼의 라멜라 고차구조 안정도를 조사하기 위해 뮬러 매트릭스 편광법(MMP)을 도입되었다. 에멀젼 내 고차구조를 통과하는 빛은 매질의 굴절률 차이로 인해 위상차를 발생하게 되고, 이러한 이방성 특징으로 인해 MMP는 액정에멀젼의 고차 구조 안정도 평가를 할 수 있다. 25 °C 및 45 °C에서 12주간의 안정도 평가 결과, 액정에멀젼의 고차구조는 고온에서도 매우 안정함을 확인할 수 있었다. 마지막으로 공초점 라만분광을 이용하여 in vivo 피부흡수 평가를 수행하였다. 그 결과, 액정 에멀젼이 O/W에멀젼보다 우수한 피부흡수 효과를 확인할 수 있었다. 앞서 언급한 대로 액정에멀젼의 피부흡수 촉진효과에 대한 정확한 기작은 아직 규명되지 못하였다. 다만, 액정에멀젼 내 존재하는 고급 지방 알코올과 세라마이드 등 지질원료들이 피부 각질층 지질을 유동화시켜 효능성분의 피부흡수를 촉진시킨다는 가설이 가능하다. 물론, 이러한 가설 검증은 향후 NMR, WAXS, 라만분광 임상을 통해 검증해야 할 과제이기도 하다. 마지막으로 세라마이드 함유 액정에멀젼의 손상된 피부장벽 회복효과를 확인 하였다. 이를 위해 고함량 세라마이드가 액정에멀젼에 안정적으로 함입될 수 있도록 처방 설계를 수행하였다. 액정에멀젼의 라멜라 구조 내에서 세라마이드는 고급 지방 알코올과 상호인력을 통해 안정화될 수 있다. 또한, 세라마이드 함량 증가에도 불구하고 세라마이드는 고급 지방 알코올과의 상호인력에 의해 액정에멀젼 내에서 안정하게 존재한다. 한편, SAXS 및 WAXS 분석을 통해 고함량 세라마이드가 액정 에멀젼의 라멜라 고차구조에 큰 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다. 마지막으로 세라마이드의 손상된 피부장벽 회복효과를 확인하기 위해 in vivo 임상평가를 수행 하였다. 그 결과, 세라마이드를 함유한 액정에멀젼과 O/W 에멀젼은 D1, D2 및 D6에서 무도포군 대비 유의미한 피부장벽 개선효과를 확인할 수 있었다. 반면, D14에서는 액정에멀젼만이 유의미한 피부장벽 회복효과를 보여주었다. 하지만, 액정 에멀젼과 O/W에멀젼 사이의 유의차는 존재하지 않았다. 이 연구를 통해 우리는 액정에멀젼이 고함량 세라마이드를 안정화시킬 수 있고, 이를 통해 손상된 피부 장벽의 빠른 회복에 효과가 있다는 것을 확인하였다.; Recently, cosmeceutics have attracted much interest for the improved skin penetration and the recovery of skin barrier in the field of cosmetics. Ceramide is one of the most highly regarded cosmeceutical materials and has been shown to be effective in skin efficacy. It is one of the major components in intercellular lipids of stratum corneum (SC), and contributes greatly to maintaining the homeostasis of the skin such as skin barrier function. However, it causes some problems such as gelation or crystallization in colloidal formualtion due to high crystallinity, making it hard to use in the cosmetic field. The purpose of this study is to improve the skin efficacy by stabilizing ceramide in colloidal formulations and examine the effect of ceramide for the boosting of skin efficacy. We first fabricate ceramide containing nanovehicles (CNV) by molecular interactions among lecithin, ceramide and choleth-24. CNV exhibited excellent colloidal stability against harsh conditions such as temperature elevation and high salinity. In vitro skin barrier recovery test using a 3D skin model and SAXS was investigated for the effect of ceramide in skin efficacy. LPP (Long periodicity phase), which is a constant distance of lipids forming lamellar structure in SC intercellular lipids, can be a measure of skin barrier. We damaged SC using anionic surgactant (SDS), and confirmed the absence of LPP by SAXS analysis. And, bare nanovehicles (NV) and CNV were treated, respectively. Thus, there was no change in NV treatment, but LPP restoration was confirmed by CNV treatment. This indicates the direct contribution of ceramide to reconstruct the SC layer. And, in vivo skin penetration study was performed using confocal Raman spectroscopy. As a result, CNV showed the improved skin penetration. Although we can not identify the improved skin penetration mechanism by ceramide, we can postulate that ceramide may fluidize SC lipids, looseing the packing structure of SC lipids, and making actives possible to penetrate into the SC. Second, we prepared LC emulsions with highly ordered structure. From the result of the polarization microscopy, fatty alcohols are the essential compositions for the formation of higher order structure. And, surfactants are also important to stabilize the higher order structure. When surfactants are molecularly interacted with fatty alcohols in cosmetic formulation, LC emulsions with higher order structure are formed. This higher order structure was identified as lamellar structure with an interspacing distance of about 200 Å by SAXS analysis. In this study, we introduced Mueller matrix polarization (MMP) in order to investigate the long-term stability of higher order structure. Since the higher order structure in cosmetic formulation has anisotropic property, MMP can obtain the optical information of the higher order structure. As a result of 12 weeks test, the higher order structure of LC emulsions shows extremely stable at 25 and 45 °C. Finally, we performed in vivo skin penetration study using confocal Raman spectroscopy. As a result, LC emulsions shows more improved skin penetration than O/W emulsions. Therefore, the present LC emulsions have highly colloidal stability and show the improved carrier in topical applications. Finally, we fabricated LC emulsions including high amounts of ceramides. Ceramide is highly crystalline substance, and easily to crystalize in cosmetic formulation. Because ceramides are molecularly interacted with fatty alcohols, LC emulsions can easily suppress the crystallization of ceramide. And, the results of X-ray scattering analyses show that ceramide does not affect higher order structure and lateral packing state of LC emulsions. And, we performed in vivo skin barrier recovery test for the damaged skin. As a result, LC emulsions and O/W emulsions show significant effects of skin barrier recovery at D1, D2 and D6 compared to the untreated condition. While only LC emulsions show significant effect at D14. However, there was no statistically significant difference between both formulations. We expect that LC emulsions are the promising carrier to stabilize ceramide in cosmetic formulation and can improve the skin barrier function.